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文章背景簡介   

BACKGROUND INTRODUCTION

白細胞介素-6 (Interleukin-6，IL-6)由多種免疫類型細胞分泌，是一種能與IL-6受體結合的多效細胞因子，具有免疫調節(jié)、參與炎癥反應等多種生物學功能。并且，IL-6具有顯著的臨床意義，在多種疾病或傳染病，如膿毒癥、急性呼吸窘迫綜合征(ARDS)、COVID-19患者體液中顯著升高。此外，IL-6的表達失調可引起許多疾病或導致疾病惡化，如加重炎癥病癥，以及通過激活多種信號通路和增強抗凋亡蛋白的表達來加快癌癥進展。IL-6作為信號通路已經研究了十多年，目前IL-6抑制劑已被證明可有效治療慢性關節(jié)炎(JIA)、大動脈炎和巨細胞動脈炎(GCA)、細胞因子釋放綜合征(CRS)和其他嚴重疾病。

重鏈抗體(Heavy chain antibodies，HCAbs)最早由Raymond Hamers-Casterman教授在單峰駱駝中發(fā)現，它們僅由兩條重鏈組成，既缺失了傳統(tǒng)抗體的輕鏈結構，又缺少重鏈抗體恒定區(qū)VHH結構。重鏈中含有的一個可變抗原結合域(VHH)，稱為納米抗體(Nb )，其結構中含有的互補性決定區(qū)3(CDR3)環(huán)與框架2(FRW2)相互作用以保持Nb結構的穩(wěn)定性。與天然抗體相比，Nb FRW2 中有四個親水性標記(F37、E44、R45和G47)，增加了Nb的可溶性和單體表達。因Nb具有分子量小、親和力高、溶解度高、穩(wěn)定性好、滲透性強等特性，使其得到了廣泛的應用。但在臨床使用中，非人源化的Nb可能會導致強免疫原性。因此，納米抗體人源化將是推進Nb應用的關鍵一步。

為了獲得靶向抑制IL-6的人源化納米抗體，華東理工大學的Lei Wang等人，開展了相關研究，并于2024年在《Frontiers in Bioengineering and Biotechnology》期刊（IF=6.064；Q1區(qū)）發(fā)表了題為“Development of a synthetic library of humanized nanobodies for targeted IL-6 inhibition”的文章。

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所用到的主要方法

METHODS   

（1）計算機模擬與分析：用計算機預測和評估生物分子（如蛋白質、基因等）的性質和分析模擬過程的方法。

（2）圓二色光譜(CD)：應用最為廣泛的測定蛋白質二級結構的方法，是研究稀溶液中蛋白質構象的一種快速、簡單、較準確的方法。CD譜的noise.通過測量生物分子對左、右圓偏振光不同程度的吸收差異（稱為圓二色性）來揭示分子的結構和構象信息。

（3）活體熒光成像

（4）流式細胞術

（5）重疊延伸PCR：是在PCR的基礎上，采用具有互補末端的引物，使PCR產物形成了重疊鏈，從而在隨后的擴增反應中通過重疊鏈的延伸，將不同來源的擴增片段重疊拼接起來的新技術。

（6）ELISA

（7）共聚焦顯微成像。

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文章主要內容摘要

ABSTRACT 

IL-6參與炎癥擴增、腫瘤進展和許多其他疾病的發(fā)展。納米抗體具有結構小、親和力高的特點，在醫(yī)學診斷和治療中是一種功能強大、運用廣泛的工具。本研究基于已優(yōu)化的能夠進行抗體人源化并提高穩(wěn)定性的支架，開發(fā)了一種合成噬菌體展示文庫，該文庫可快速生成高親和力和人源化的納米抗體，無需動物免疫。以增強型綠色熒光蛋白( EGFP )為代表，證明該文庫產生的人源化納米抗體具有高功能和細胞內強穩(wěn)定性。然后利用該文庫進行抗IL-6的篩選，發(fā)現了一個突出的納米抗體NbL3，它具有高親和力( 22.16 nM )和強穩(wěn)定性，并且在相對較低的濃度下顯著抑制IL -6對人乳腺癌細胞MCF-7遷移的作用。NbL3 的強抑制活性為IL -6 靶向干預策略提供了一種有希望的治療選擇。

簡而言之，本研究的主要內容有：

（1）分析了大量的納米體-抗原復合物，確定了以納米抗體Nb6B9為模板，再進行合理設計支架及隨機化改變CDR區(qū)。

（2）通過圓二色性(CD)和HEK293T細胞的實時成像來表征納米抗體體外和細胞內的穩(wěn)定性。

（3）通過計算機模擬與分析，合成了涉及所需結構和序列多樣性的引物，進行幾次 PCR 循環(huán)，成功構建了有效庫容量為3.7 ×109的人源化納米體合成文庫。

（4）使用EGFP對文庫進行篩選,評估文庫是否會產生特異性強和功能性高的EGFP結合物。

（5）利用文庫鑒定并驗證靶向IL-6的人源化納米抗體，確定了納米抗體NbL3可顯著阻斷了IL-6和IL-6R與MCF-7細胞的結合。

       原文標題 : 靶向抑制IL-6人源化納米抗體文庫的建立