這種使用自體CAR－T細胞的傳統(tǒng)制造和治療所涉及的物流增加了臨床醫(yī)生和患者的復(fù)雜性，如今，這種療法帶來了一些些主要的制造業(yè)挑戰(zhàn)，其中包括：

CAR－T細胞的包裝、運輸和儲存

CAR－T細胞的臨床制造目前是一個復(fù)雜的過程，涉及多個步驟，跨越不同的地理位置，采用多種技術(shù)和物流。任何時間、運輸方法、冷鏈或儲存方面的錯誤都會導(dǎo)致細胞損傷，直接影響治療效率，因此每一個步驟都需要仔細管理、精確的樣本跟蹤和足夠的保存技術(shù)來冷凍患者樣本。在整個CAR－T細胞制造過程中，需要不同溫度的不同運輸，因此，在生產(chǎn)過程中進行的低溫保存必須保證質(zhì)量控制。

良好制造規(guī)范（GMP）

CAR－T細胞是一項復(fù)雜的制備過程，cGMP是CAR－T細胞生產(chǎn)的關(guān)鍵和瓶頸。cGMP的目的是提供一個框架，確保訓(xùn)練有素和定期培訓(xùn)的員工在良好控制的設(shè)施和設(shè)備中進行高質(zhì)量生產(chǎn)。同樣，它提供了涵蓋所有運營方面的嚴(yán)格文件流程，以證明持續(xù)和充分的合規(guī)性。

根據(jù)國際標(biāo)準(zhǔn)化組織（ISO）， CAR－T細胞制造需要GMP設(shè)施作為細胞處理潔凈室，必須配備1）設(shè)施系統(tǒng)（如空氣處理器、24／7報警監(jiān)控系統(tǒng)）；2）環(huán)境監(jiān)測設(shè)備（如粒子計數(shù)器）；3） 制造工藝設(shè)備（如細胞清洗機、生物反應(yīng)器）；4）分析設(shè)備（如自動細胞計數(shù)器、流式細胞儀）。

維持符合GMP要求的生產(chǎn)環(huán)境的另一個關(guān)鍵因素是高技能員工，他們對GMP生產(chǎn)、質(zhì)量控制和質(zhì)量保證應(yīng)具備廣泛的知識。

慢病毒載體（LV）的制備

LVs的生產(chǎn)面臨諸多挑戰(zhàn)，例如其固有的細胞毒性、低穩(wěn)定性以及對瞬時轉(zhuǎn)染影響的依賴性，此外，上游和下游過程的產(chǎn)量低且成本高效益低。這部分已成功的商業(yè)化產(chǎn)品部分是建立了標(biāo)準(zhǔn)化和穩(wěn)定的細胞系，以產(chǎn)生促進GMP合規(guī)過程的LVs，從而可以提供更容易的放大、再現(xiàn)性、生物安全性和成本效益。

工作人員和培訓(xùn)

考慮到治療的復(fù)雜性及其相關(guān)的高風(fēng)險副作用，CAR－T細胞的使用受到高度管制，只能在認(rèn)證中心使用，并由訓(xùn)練有素的工作人員管理。所有參與CAR－T細胞制造的員工（從T細胞收集到制造商，再到臨床單位）都需要經(jīng)過廣泛的培訓(xùn)，具備令人滿意的能力水平。這種能力能夠管理過程中可能出現(xiàn)的復(fù)雜情況，從而能夠交付產(chǎn)品。

如今，在這個領(lǐng)域只有少數(shù)具備資格的專業(yè)人員，需要多學(xué)科協(xié)作和交流來創(chuàng)造這一領(lǐng)域的更多知識，學(xué)術(shù)參與也是一個重要方面。

質(zhì)量控制

作為一種活的“藥物”，CAR－T細胞具有復(fù)雜的制備過程，需要“全過程質(zhì)量控制”。在生產(chǎn)過程中，良好控制的冷鏈運輸和儲存在確保細胞產(chǎn)品質(zhì)量和防止細菌和支原體污染方面發(fā)揮著重要作用。CAR－T細胞質(zhì)量控制的要求包括檢查體外轉(zhuǎn)導(dǎo)的T細胞是否存在病毒復(fù)制和生產(chǎn)材料殘留。

此外，考慮到CAR－T細胞作為生物產(chǎn)品、細胞產(chǎn)品和基因治療產(chǎn)品的特性，還應(yīng)包括成品的放行試驗，以確認(rèn)其特性、純度、安全性和效力。

此外，還需要進行穩(wěn)定性研究，以驗證儲存條件及其保質(zhì)期。CAR－T細胞的產(chǎn)生需要更深入的研究，以評估復(fù)發(fā)和回輸患者的T細胞質(zhì)量。這些研究應(yīng)提供有關(guān)淋巴細胞群分布的數(shù)據(jù)。總之，質(zhì)量控制對于CAR－T治療的成功至關(guān)重要。

生產(chǎn)放大

CAR－T細胞的制造應(yīng)具有可擴展性（即，為每位患者配備多個單一生物反應(yīng)器），以便在不犧牲產(chǎn)品質(zhì)量和可重復(fù)性的情況下，擴大惠及患者的范圍。個性化治療（如自體細胞治療）不像普通生物制藥那樣只是增加體積，而是需要更精細的放大，即擁有多個生物反應(yīng)器來放大每個患者的CAR－T細胞。此外，這取決于平行實現(xiàn)多個獨立產(chǎn)品的能力。

制造時間和重復(fù)給藥

CAR－T細胞的制造可能需要長達4周的時間，在這段時間內(nèi)，患者極易遭受疾病進展和死亡的風(fēng)險。此外，CAR－T細胞制造不允許體積放大，因此，細胞必須作為單個批次制備，限制了可用產(chǎn)品的數(shù)量。在這種情況下，患者可能沒有機會快速、方便地接受新的CAR－T細胞輸注。

定價和可及性

定價和患者可及性是在全世界普及CAR－T細胞使用的最主要限制。目前的CAR－T細胞制造模式高度集中，且每個步驟的過程都很復(fù)雜，導(dǎo)致每次治療的費用高達37．3萬美元至47．5萬美元（與治療相關(guān)的醫(yī)院費用不計入此類平均費用），患者和醫(yī)療系統(tǒng)都負擔(dān)不起。

這一令人望而卻步的成本限制了患者獲得治療的機會，尤其在社會經(jīng)濟不發(fā)達的國家無法持續(xù)，這進一步限制了CAR－T細胞療法的廣泛應(yīng)用。在CAR－T細胞療法變得經(jīng)濟實惠之前，其治療潛力將無法真正得到實現(xiàn)。

法規(guī)要求

細胞產(chǎn)品的另一個重要瓶頸是監(jiān)管。CAR－T細胞在全球范圍內(nèi)被視為高級治療藥物產(chǎn)品（ATMP），這些產(chǎn)品需要許可證。監(jiān)管機構(gòu)與標(biāo)準(zhǔn)療法高度相關(guān)，但細胞產(chǎn)品有特殊要求。美國或歐盟監(jiān)管機構(gòu)正在努力定義最佳指南，以在全球范圍內(nèi)協(xié)調(diào)ATMP臨床制造的要求。與此同時，不發(fā)達國家面臨著更大的挑戰(zhàn)，因為CAR－T療法在臨床中的使用受到極大限制，導(dǎo)致當(dāng)局對監(jiān)管要求缺乏了解。

增強CAR－T細胞技術(shù)使用的策略

新生物標(biāo)志物的發(fā)現(xiàn)

生物標(biāo)記物對于癌癥臨床治療具有重要意義，它們可以用來確定適合CAR－T治療的患者、預(yù)后、治療反應(yīng)預(yù)測和監(jiān)測疾病進展。CAR－T治療的第一個生物標(biāo)志物是CD19，一種主要在惡性B細胞上表達的B細胞表面蛋白。

目前，正在根據(jù)免疫治療的階段尋找不同的生物標(biāo)志物，包括確定患者基線狀態(tài)的生物標(biāo)志物、CAR－T細胞功能、CAR－T細胞耗竭、CAR－T細胞毒性的生物標(biāo)志物以及癌癥預(yù)后、反應(yīng)和復(fù)發(fā)的生物標(biāo)志物�；�線生物標(biāo)記物包括細胞因子，如IL－2、IL－5、IL－7、TNF－a等；乳酸脫氫酶（LDH）和CD9細胞已被廣泛應(yīng)用。對于CAR－T細胞功能，提出了以下生物標(biāo)記物：CD45RA、CD45RO、CD62L、CCR7、CD27、CD28、CD25、CD127、CD57和CD137。目前，還沒有成熟的生物標(biāo)志物可用于評估患者輸注后的CAR－T細胞耗竭。一些間接參數(shù)可能有助于實現(xiàn)這一目的，如PD－1、LAG－3、TIM－3等抑制性受體的高水平表達。

盡管CAR－T治療取得了重大進展，但仍有必要繼續(xù)探索不同的癌細胞類型特異性生物標(biāo)記物，以開發(fā)更特異的治療方法。

異基因CAR－T細胞

目前，大多數(shù)CAR－T細胞免疫治療是使用自體T細胞產(chǎn)生的。這在不同層面上表現(xiàn)出若干不利因素，如生產(chǎn)過程可能耗時長且復(fù)雜，導(dǎo)致成本增加，此外，由于使用患者來源的T細胞進行CAR治療，面臨的挑戰(zhàn)包括CAR－T細胞增殖較弱、擴增有限和持續(xù)性差。

改善這些問題的一個機會是使用同種異體CAR－T細胞，從而減少自體細胞生產(chǎn)的時間延遲。此外，從異基因健康捐贈者中產(chǎn)生通用的CAR－T細胞更容易獲得，質(zhì)量更高。這對于需要緊急治療的侵襲性癌癥患者非常重要。該策略將擴大可接受該免疫療法的患者數(shù)量，使CAR－T細胞療法成為一種現(xiàn)成的治療方法，成本低廉，易于獲得，并將提高T細胞的質(zhì)量特性。

通用CAR－T細胞也面臨一些挑戰(zhàn)和問題。例如，供體和受體之間的免疫不匹配，如果受試者的異基因T細胞攻擊健康受體組織，可能導(dǎo)致危及生命的移植物抗宿主病（GVHD），如果受試者的免疫系統(tǒng)識別異基因T細胞并對其作出反應(yīng)，這些細胞可能會被宿主免疫系統(tǒng)迅速消除。一種可能的解決方案是通過基因敲除或破壞供體上的TCR基因和／或HLA I類基因座來消除GVHD。

與CAR－T細胞相比，CAR－NK細胞提供了更多的優(yōu)勢，例如在自體環(huán)境中降低細胞因子釋放綜合征和神經(jīng)毒性；通過IPSC的使用可以提供了無限量的“現(xiàn)成”NK細胞，對惡性細胞具有快速反應(yīng)，而不會引起GVHDs；另一個有利點是激活細胞毒性活性的多種機制（NKG2D、KIR、CD16、NKp30、NKp44、NKp46），仍然保持其靶向?qū)嶓w瘤和耐藥腫瘤微環(huán)境的滲透能力。CAR－NK臨床前研究表明，其對血液系統(tǒng)惡性腫瘤靶點（CD19和CD20）以及實體腫瘤靶點有效，證明其具有異基因治療的潛力。

改善CAR－T細胞治療的其他策略

雙靶向或串聯(lián)CARs，由兩個單獨的CARs在每個T細胞中的共表達組成，它們識別兩種不同的抗原。一些雙重CAR已進入針對CD19／CD20的血液系統(tǒng)惡性腫瘤和實體瘤的臨床試驗。HER2／MUC1雙特異性CAR在乳腺癌模型的體外試驗中具有良好的效果。雙重CAR是解決抗原異質(zhì)性和防止復(fù)發(fā)的一種非常有希望的方法。

此外，合成Notch（synNotch）受體已應(yīng)用于CAR－T細胞以提高安全性。SynNotch受體識別一種特定的腫瘤抗原，然后釋放轉(zhuǎn)錄激活域，促進CAR的局部表達。此外，synNotch調(diào)節(jié)的CAR表達可防止組成性信號傳導(dǎo)和耗竭，使更高比例的T細胞處于幼稚／干細胞記憶狀態(tài)。

抑制性嵌合抗原受體（iCAR）包含抑制性受體，如PD－1和CTLA－4，在減弱或終止T細胞反應(yīng)中起著關(guān)鍵作用，因此，它們被認(rèn)為是一種安全策略，使得T細胞能夠區(qū)分靶細胞和非靶細胞。

此外，為了有效治療實體瘤，疫苗、生物材料和溶瘤病毒等創(chuàng)新組合策略是很有前景的，因為它們可以直接增強T細胞的功能，或者招募內(nèi)源性免疫細胞以及重塑TME。

全自動化制造過程

在世界范圍內(nèi)，需要CAR－T細胞免疫治療的患者數(shù)量迅速增加，行業(yè)內(nèi)已經(jīng)開發(fā)了自動化和封閉式制造平臺，以適應(yīng)這種情況。這項工作的例子包括Cocoon?（Lonza）和CliniMACSProdigy（Miltenyi Biotec）的自動化平臺，這兩個平臺都允許細胞的復(fù)制和快速生產(chǎn)，并且每個步驟都有嚴(yán)格的記錄。2020年，Lonza和Sheba醫(yī)療中心宣布，首例患者在Sheba醫(yī)療中心接受了使用Lonza Cocoon平臺制造的CD19 CAR－T細胞免疫治療。

協(xié)作網(wǎng)絡(luò)

由于高成本和技術(shù)的高要求，目前大多數(shù)患者仍無法負擔(dān)得起CAR－T細胞治療。為了實現(xiàn)CAR－T細胞的普及，有必要在學(xué)術(shù)界、工業(yè)界和醫(yī)院等不同利益相關(guān)者之間建立一個協(xié)作網(wǎng)絡(luò)，以便在應(yīng)用這一技術(shù)的每個國家為這類產(chǎn)品制定充分而有力的立法。

因此，大學(xué)應(yīng)該為未來的專業(yè)人士提供知識和創(chuàng)新，以便他們研究新的生物標(biāo)記物發(fā)現(xiàn)、開發(fā)穩(wěn)定的細胞系、開發(fā)新的驗證產(chǎn)品質(zhì)量的分析方法以及了解不同的生產(chǎn)系統(tǒng)。應(yīng)用GMP、質(zhì)量控制和自動化流程的行業(yè)可以支持建立更標(biāo)準(zhǔn)化、更可靠、質(zhì)量更高的產(chǎn)品，還可以開發(fā)現(xiàn)場生產(chǎn)裝置，降低運輸和儲存成本。醫(yī)院必須有足夠的設(shè)施來管理這項技術(shù)，配備現(xiàn)場生產(chǎn)單位管理方面經(jīng)過培訓(xùn)的人員，以及有效治療患者的醫(yī)務(wù)人員和衛(wèi)生專業(yè)人員。

包括所有這些活動，必須在這一領(lǐng)域制定強有力的具體立法，以保證這類高級治療的質(zhì)量。此外，監(jiān)管是這一過程的重要組成部分。如今，關(guān)于不同國家監(jiān)管指南的信息很少，EMA和FDA指南已經(jīng)為這些技術(shù)建立了此類要求的基線，但臨床試驗不同階段的行為和結(jié)果將涉及新的考量因素。

小結(jié)

藥學(xué)的角度來看，CAR－T細胞被視為高級治療產(chǎn)品，其質(zhì)量必須通過其特性、安全性和有效性來證明。這三個方面中的每一個都面臨了重大挑戰(zhàn)。科學(xué)界以及工業(yè)界都需要繼續(xù)努力，在臨床方面，繼續(xù)尋找新的生物標(biāo)記物，改進CARs的開發(fā)，降低CRS和NTX的相關(guān)不良反應(yīng)，以及CAR－T細胞在實體瘤中的應(yīng)用，以提高該療法的安全性和有效性。

在制造和工藝方面，需要成本更低的生產(chǎn)系統(tǒng)，生產(chǎn)的穩(wěn)定性以及必要的質(zhì)量要求，這些都是持續(xù)的挑戰(zhàn)。此外，這些過程必須完全符合國際和國內(nèi)監(jiān)管部門制定的要求。

最后，需要各方面的專業(yè)人員在各個階段的多學(xué)科參與。通過學(xué)術(shù)界、工業(yè)界、醫(yī)院和政府在國際和地區(qū)層面的緊密合作，將有可能使更多的患者更廣泛地受益于這項新型的技術(shù)。

參考文獻：

1．Chimeric Antigen Receptor－TCells： A Pharmaceutical Scope． Front Pharmacol． 2021； 12： 720692．