-01-導讀

過繼轉(zhuǎn)移嵌合抗原受體（CAR）T細胞是一項強有力的技術(shù)，它徹底改變了免疫治療的方式。其在難治性和復(fù)發(fā)性血液系統(tǒng)惡性腫瘤中完全和長期的療效令人印象深刻，這也為實體腫瘤的治療開辟了新的可能性。然而，細胞治療的廣泛應(yīng)用受到了T細胞轉(zhuǎn)染常用病毒載體自身局限的阻礙。在mRNA疫苗和CRISPR/Cas9精準基因編輯的時代，新的無病毒T細胞工程化方法正在成為下一代CAR-T細胞制造的更通用、靈活和可持續(xù)的替代方法。

-02-困局突圍：病毒載體的阿喀琉斯之踵

迄今為止，臨床試驗中批準或研究的大多數(shù)CAR-T細胞治療都是利用病毒載體，特別是逆轉(zhuǎn)錄病毒和慢病毒載體。病毒載體是具有高效基因轉(zhuǎn)移和長期應(yīng)用歷史的標準化系統(tǒng)，已經(jīng)證明了在過繼性T細胞治療的安全性。

然而，病毒載體轉(zhuǎn)導長基因的能力受到衣殼的限制。病毒衣殼直徑大約為100nm，通常不能容納超過8-9 kb的基因。然而，隨著CAR-T技術(shù)的更新迭代，需要轉(zhuǎn)入額外的激活原件或者不同特異性的CAR，實現(xiàn)更高的藥效、安全性和適用性。

此外，臨床應(yīng)用的病毒生產(chǎn)通常需要兩到三周的時間，在GMP條件下和生物安全2級（BSL2）設(shè)施中進行，需要經(jīng)過熟練培訓的員工。這種高成本、復(fù)雜性以及個性化治療的需要最終影響了CAR-T產(chǎn)品的價格，可能達到每人數(shù)十萬美元，使普通的患者望而生畏。

最后，病毒載體具有固有的免疫原性風險，這是由對載體編碼表位的體液和細胞免疫反應(yīng)引起的，這可能限制轉(zhuǎn)導細胞的效力和持久性。

-03-破冰利器：非病毒CAR-T工程化平臺解析

睡美人轉(zhuǎn)座子

與病毒系統(tǒng)相比，這種策略的一大優(yōu)勢是更大的裝載能力。插入物的大小與轉(zhuǎn)座機制的效率呈負相關(guān)。最佳裝載大小不高于6kb。但其升級版本包括兩個完整的轉(zhuǎn)座子單元，可以將負載增加到11kb，從而擴充了基于SB載體的克隆能力。此外，當與細菌人工染色體（BACs）結(jié)合時，SB在人類胚胎干細胞中可以傳遞高達100 kb的轉(zhuǎn)基因。

在臨床應(yīng)用方面，Cooper等人的團隊首次將SB工程化抗CD19 CAR-T細胞應(yīng)用于臨床試驗，兩項臨床試驗（NCT00968760、NCT01497184）證實了SB工程化抗CD19 CAR-T細胞在26例B-ALL和非霍奇金淋巴瘤患者自體或異基因造血干細胞移植（HSCT）后作為輔助治療的安全性。

PiggyBac轉(zhuǎn)座子

與SB載體一樣，PB系統(tǒng)由PB轉(zhuǎn)座酶（PBase）構(gòu)成，其形式為mRNA或DNA，以及攜帶所需基因的單獨轉(zhuǎn)染質(zhì)粒。PB在哺乳動物細胞中具有比SB更高的轉(zhuǎn)座子動員轉(zhuǎn)座活性，比病毒載體具有更大的裝載能力（高達14 kb），并允許通過設(shè)計多順反子盒進行多個轉(zhuǎn)基因傳遞。

在澳大利亞開展的CARTELL試驗是一項I期臨床研究（ACTRN12617001579381），旨在研究通過PB轉(zhuǎn)座子系統(tǒng)獲得的供體衍生抗CD19 CAR-T細胞的療效和安全性。早期結(jié)果表明，其活性類似于用高應(yīng)答率病毒載體生成的抗CD19 CAR-T細胞。另外，分別在日本（UMIN000030984）和中國（NCT04289220）進行的兩項I期研究正在調(diào)查使用PB系統(tǒng)制造的抗CD19 CAR-T細胞的可行性和安全性。在日本的研究中，到目前為止，沒有一名患者顯示出劑量限制性毒性。一名患者表現(xiàn)出持續(xù)9個月的B細胞再生障礙。

mRNA

RNA適合多種細胞轉(zhuǎn)染方法，包括電穿孔、陽離子脂質(zhì)和陽離子聚合物。已經(jīng)有許多體外和體內(nèi)臨床前研究，通過mRNA將CAR引入T細胞，用于在血液腫瘤和實體瘤的模型系統(tǒng)中進行測試。雖然基于mRNA的治療被證明可以減少靶向效應(yīng)、降低毒性并緩解整合相關(guān)的安全性問題，但蛋白質(zhì)表達的瞬時性在這些應(yīng)用中也是一個缺點。

-04-技術(shù)創(chuàng)新：多學科交叉突破

納米載體

為了應(yīng)對未來的挑戰(zhàn)，除了轉(zhuǎn)座子平臺外，基因工程的另一個非病毒工具是納米載體，納米載體的使用正在成為一種可能的解決方案，以克服目前基因傳遞中的障礙，例如毒性和低轉(zhuǎn)染效率。

在納米技術(shù)的最新進展中，作為最前沿的發(fā)現(xiàn)之一，Bozza等人開發(fā)了一種非整合DNA納米載體，能夠生成在體外和體內(nèi)都具有活性的CAR-T細胞。該平臺不含病毒成分，能夠在分裂細胞的細胞核中進行額外的染色體復(fù)制，在不需整合的情況下維持持續(xù)的轉(zhuǎn)基因表達。此外，它還具有非病毒載體的所有優(yōu)點：非免疫原性、簡單、多功能且生產(chǎn)成本低廉。

新型生物材料

另一方面，通過使用開發(fā)的新型生物材料來改善CAR-T細胞的分離、激活和基因修飾，正在取得進展。一個例子是使用合成DNA適配體和互補逆轉(zhuǎn)技術(shù)，允許從PBMC中分離出高純度和高產(chǎn)量的無標記CD8+T細胞。這種方法的最大優(yōu)點是可以通過具有不同特異性的適配體在單個分離步驟中分離多個不同的T細胞群。

基因編輯

基因編輯和靶向敲除分別依賴于宿主DNA雙鏈斷裂（DSB）修復(fù)和同源定向修復(fù)（HDR）過程，HDR通常在原代細胞中發(fā)生頻率較低，并且僅限于小的轉(zhuǎn)基因，導致轉(zhuǎn)染效率較低。為了更高效地提供DNA插入，CRISPR/Cas9最近與轉(zhuǎn)座子結(jié)合，以提高RNA引導整合的效率，使用轉(zhuǎn)座酶催化整合。為此，有研究小組進行了將CRISPR/Cas9與SB轉(zhuǎn)座子結(jié)合的實驗，結(jié)果表明，它們適用于未來的非病毒臨床應(yīng)用。識別和降低基因組重排和易位風險的方法可以允許在免疫治療中進一步開發(fā)基因編輯的潛在臨床應(yīng)用。

-05-結(jié)語：非病毒性CAR-T的星辰大海

迄今為止，成功的CAR-T細胞治療都與用病毒載體工程化的T細胞有關(guān)。然而，復(fù)發(fā)、制造過程的復(fù)雜性以及這些技術(shù)在包括實體瘤在內(nèi)的其他疾病中的應(yīng)用，需要更復(fù)雜的設(shè)計和基因轉(zhuǎn)移技術(shù)來適應(yīng)這些挑戰(zhàn)。為了填補這些空白，非病毒技術(shù)正在不斷取得進展，并正在改寫CAR-T療法的底層邏輯：從“天價特藥”走向“普惠醫(yī)療”，從血液瘤單點突破到全面攻克實體瘤與自身免疫病。盡管仍需克服持久性、工藝標準化等挑戰(zhàn)，但結(jié)合基因編輯、納米技術(shù)與合成生物學的發(fā)展，非病毒CAR-T有望在未來5-10年內(nèi)引領(lǐng)細胞治療進入“工業(yè)化時代”。

參考文獻：

1.The Past, Present, and Future of Non-Viral CAR T Cells. Front Immunol.2022; 13: 867013.

       原文標題 : 非病毒性CAR-T如何重塑細胞治療行業(yè)格局