附圖1D：在患者標(biāo)本中對于所有細(xì)胞的聚類結(jié)果

對于無法通過自舉分析分離的的生物學(xué)相關(guān)亞型（例如，來自腫瘤和腫瘤周圍組織的淋巴EC），作者根據(jù)先前的研究，確定它們在統(tǒng)計學(xué)上是可以使用成對差異分析來分離的。13個表型中的每一個都按圖1C所示編號（H1，H2等）。

作者根據(jù)hPNEC和hTEC中排名最高的標(biāo)記基因的相對豐度對亞型進(jìn)行生物學(xué)注釋，并對顯著的標(biāo)記基因表達(dá)水平差異進(jìn)行統(tǒng)計量化以支持定性生物學(xué)注釋（圖1D–1G和S1E）。

圖1D：t－SNE聚類后的亞群標(biāo)記基因的表達(dá)分布情況 

E：標(biāo)記基因在不同亞組中的表達(dá)熱圖 

F：在hTECs和hpNECs不同EC亞型的占比 

G：每種亞型在hTEC和hpNEC中的占比情況

為了獲得更可靠的解釋，作者關(guān)注不同亞型的特異基因集并基于規(guī)范的基因集（表S5）對亞型進(jìn)行分析。為了提高分析的通用性，所有聚類的分類都被分析了至少一次。

作者對先前記錄亞組中排名最高的標(biāo)記基因作用的詳細(xì)描述，用于推斷每個亞型的假定生物學(xué)作用。

表S5（部分）：用于定義聚類的基因集

作者對于每一個聚類的通過其高表達(dá)基因集進(jìn)行了生物學(xué)功能的分析：

動脈EC（簇H1）表達(dá)的基因涉及血管完整性，體內(nèi)穩(wěn)態(tài)和血管收縮（圖2A），而毛細(xì)血管后靜脈EC（H2）表達(dá)的基因與白細(xì)胞募集，組織灌注和肺動脈血壓有關(guān)（圖2B）。

作者確定了I型（H3）和II型（H4）肺泡毛細(xì)血管EC表型，其特征在于血管性血友病因子（vWF，II型相比I型上調(diào)；倍數(shù)＝ 3．63，adj．p＜0．001）和黏蛋白（EMCN，I型與II型相比上調(diào)；倍數(shù)＝ 2．89，adj．p＜0．001），它們可能分別參與血管調(diào)節(jié)和抗微生物防御（圖2C–  2E）。

與所有其他簇相比，毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)了參與MHC－II介導(dǎo)的抗原呈遞和加工的基因，其表達(dá)水平高于其他表型（圖2F），但共刺激分子CD80和CD86卻未檢測到，提示其具有專職抗原呈遞細(xì)胞（APC）的功能。

確定了2種可能由腫瘤源性細(xì)胞因子誘導(dǎo)的新型毛細(xì)血管表型：清除毛細(xì)血管（scavenging capillaries ）（H5）在自舉分析結(jié)果中顯示出類似于II型毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞的特征，而其清除受體和與巨噬細(xì)胞及抗原加工相關(guān)的基因上調(diào)表達(dá)（圖2G，2H 和S1D），激活毛細(xì)血管（H6）則表達(dá)EC激活標(biāo)記（圖2I）。

中間毛細(xì)血管EC表型（H7）類似于活化的毛細(xì)血管，但其主要由單個患者衍生的細(xì)胞組成。

圖2：肺正常組織EC各亞型的基因表達(dá)差異情況

作者隨后探究了在腫瘤組織中特異性的EC，結(jié)果顯示：

傳統(tǒng)的血管生成表型，例如tip和增生的EC（假定為抗血管生成治療［AAT］的靶標(biāo)），僅在hTEC中可檢測到（圖3A，S1E和S2A）。tip EC（H8）與EC遷移，基質(zhì)重塑和血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）信號傳導(dǎo)相關(guān)的基因特征相關(guān)（圖3B），但其僅在少數(shù)（＜10％）hTEC中被檢測到（圖S1E）。

值得注意的是，tip hTECs顯示出疾病特異性分子PGF（胎盤生長因子；PlGF ）的高度限制表達(dá)。

發(fā)現(xiàn)了一個不成熟的hTEC表型（H9）與tip  EC相似，但是其上調(diào)的基因參與了新生血管的成熟，血管屏障完整性和Notch信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，作者推測其可能類似于莖狀EC（圖3C和S1D） 。

僅在一部分患者中檢測到增殖的hTECs，占hTECs的＜1％，并且在批量校正后不再作為單獨(dú)的簇被檢測到（圖S2A）。

在hTECs中，激活的毛細(xì)血管后靜脈表型（H10）上調(diào)表達(dá)了免疫調(diào)節(jié)因子和核糖體蛋白（圖3D），這是發(fā)炎組織中高內(nèi)皮小靜脈（HEVs）的特征。

與血管內(nèi)皮細(xì)胞廣泛的表型異質(zhì)性相反，腫瘤和腫瘤周圍淋巴內(nèi)皮細(xì)胞（LEC；H11，H12）的基因表達(dá)特征高度相似，并且未檢測到LEC亞群（圖3E和S1）。

圖3：A：hnNEC與hTEC之間的EC表型差異 

D－C：不同EC之間的基因表達(dá)差異

附圖2A：各樣品中增殖EC的存在情況

為了探索本研究中采用的NSCLC EC分類標(biāo)準(zhǔn)的通用性，作者使用了排名最高的標(biāo)記基因來訓(xùn)練機(jī)器學(xué)習(xí)算法，以自動注釋方式從來自5位未接受過治療的NSCLC患者（公開數(shù)據(jù)集）的腫瘤的52，698個細(xì)胞目錄中以計算機(jī)方式注釋574個hPNEC和638個hTEC。大多數(shù)EC分類具有高置信度注釋（相似性閾值＞ 0．5）（圖3F），這表明分類法是外部有效的。

圖3F：將hTEC和hPNEC表型與組織分類相關(guān)聯(lián)的�；鶊D

作者使用正交技術(shù)以驗(yàn)證分類法的可靠性，通過免疫染色結(jié)合定量RNA雜交計數(shù)轉(zhuǎn)錄本數(shù)期望證實(shí)CD31 ＋ ／ CXCR4高tip hTECs中的PGF水平被上調(diào)

免疫染色：

三重免疫染色顯示CXCR4和PlGF在TEC中共定位（圖3G和3H； S2B）。

SELP的免疫染色證實(shí)了激活的毛細(xì)血管后靜脈EC的特征（圖S2C和S2D）

vWF和EFNB2分別為靜脈和動脈表型（圖S2E–S2H）

HEV特異性MECA－79抗原是HEV表型的特征（圖S2I）

圖3G：細(xì)胞中轉(zhuǎn)錄本PGF和CXCR4的表達(dá)情況及計數(shù)

圖3H：NSCLC腫瘤血管的RNAscope圖像（CXCR4（白色）PGF（綠色）CD31（紅色）細(xì)胞核（Hoechst））

附圖2B：對CD31，PLGF和CXCR4免疫染色的人NSCLC腫瘤切片的代表性顯微照片

附圖2C－H：NSCLC腫瘤切片（左）正常肺（右側(cè)）的免疫熒光照片 

I：對CD31和MECA79免疫染色的人NSCLC腫瘤切片照片

RNAscope：

RNAscope結(jié)合EC標(biāo)記CD31的染色顯示，動脈（EFNB2）和靜脈（ACKR1）標(biāo)記轉(zhuǎn)錄本不在同一hTEC中共定位（圖S3A和S3B）

活化毛細(xì)血管hTECs表達(dá)了標(biāo)記CCL14（圖S3C）。

清除毛細(xì)血管標(biāo)記CD52和CD68以及I型毛細(xì)管標(biāo)記EDNRB和IL1RL1的轉(zhuǎn)錄本共定位在同一hTEC中（圖S3D和S3E）。