文章背景簡(jiǎn)介

半纖維素是由木糖,甘露糖,阿拉伯糖和半乳糖單元組成的多糖混合物。甘露聚糖分為線性甘露聚糖,葡甘露聚糖,半乳甘露聚糖和半乳葡甘露聚糖。它們的主鏈由D-甘露糖殘基或D-甘露糖和 D-葡萄糖殘基配體通過β-1,4-糖苷鍵連接。半乳甘露聚糖和半乳葡甘露聚糖在甘露糖殘基的C6位含有通過β-1,6-糖苷鍵連接的半乳糖側(cè)鏈。甘露聚糖作為優(yōu)良的膳食纖維,具有多種治療效果和保健功能,

如減少飲食中脂肪的吸收和促進(jìn)腸道益生菌的生長(zhǎng)。此外,甘露聚糖可用作生物質(zhì)進(jìn)行乙醇發(fā)酵。

β-1,4-甘露聚糖酶(EC 3．2．1．78)是一種內(nèi)切酶,廣泛分布在低等動(dòng)物,植物和微生物的胞外分泌物中。與外切酶不同,β-1,4-甘露聚糖酶隨機(jī)水解甘露聚糖主鏈內(nèi)的 β-1,4-糖苷鍵,產(chǎn)生甘露寡糖。根據(jù)其氨基酸序列,β-1,4-甘露聚糖酶在CAZy數(shù)據(jù)庫(kù)中分為糖苷水解酶(GH)5、26、113和134家族。在GH 5、26和113家族中,所有β-甘露聚糖酶均具有典型的(β/α)8 TIM-桶蛋白折疊結(jié)構(gòu),并具有保留催化機(jī)制。近來,在構(gòu)巢曲霉中發(fā)現(xiàn)了一種 β-甘露聚糖酶,通過進(jìn)行性質(zhì)研究將其歸類為新的GH134家族。隨后對(duì)來自鏈霉菌屬的GH134家族β-甘露聚糖酶Ss GH134進(jìn)行了結(jié)構(gòu)解析,發(fā)現(xiàn)在其催化域中具有至少五個(gè)子位點(diǎn)的獨(dú)特構(gòu)型。Ss GH134顯示出轉(zhuǎn)化催化機(jī)理,與報(bào)道的其他β-甘露聚糖酶和β-甘露糖苷酶完全不同。迄今為止,僅有一個(gè)GH134家族成員的晶體結(jié)構(gòu)被報(bào)道,但底物結(jié)合機(jī)制尚不明確。

中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)工程學(xué)院北京高級(jí)食品營(yíng)養(yǎng)與人類健康創(chuàng)新中心的尤鑫等人于2018年在《Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - General Subjects》(IF=4．021,生物2區(qū))發(fā)表了題為Structural and biochemical insights into the substrate-binding mechanism of a novel glycoside hydrolase family 134 β-mannanase的文章。

所用到的主要方法

1、ITC檢測(cè)動(dòng)力學(xué)參數(shù);

2、TLC檢測(cè)寡糖水解特性;

3、懸滴氣體擴(kuò)散法進(jìn)行結(jié)晶;

4、X射線衍射進(jìn)行結(jié)構(gòu)模擬;

5、定點(diǎn)誘變?cè)噭┖蟹ㄟM(jìn)行定點(diǎn)突變等。

文章主要內(nèi)容摘要

半纖維素是來源于高等植物的可再生資源,甘露聚糖是其的主要成分之一。β-甘露聚糖酶是一種能夠降解木質(zhì)纖維素的酶。在本研究中,克隆并表達(dá)了來自小孢根霉的內(nèi)切-β-甘露聚糖酶(RmMan134A)。重組RmMan134A的最適溫度為50°C,最適pH為5．0 ,對(duì)刺槐豆膠比活性最高(2337 U / mg)。為了深入了解RmMan134A與底物結(jié)合的機(jī)制,進(jìn)一步解析了四個(gè)復(fù)合的結(jié)構(gòu)(RmMan134A–M3,RmMan134A-M4,RmMan134A-M5和Rm Man134A-M6)。這些結(jié)構(gòu)表明,Rm Man134A的催化結(jié)構(gòu)域中至少存在七個(gè)子位點(diǎn)(?3至+4)。-1位的甘露糖與His113和Tyr131通過氫鍵相結(jié)合,形成獨(dú)特的構(gòu)象。Lys48和Val159會(huì)形成與半乳糖側(cè)鏈結(jié)合的空間位阻。此外,Rm Man134A–M5 的各種結(jié)合模式表明,在水解過程中,-2至+2的子位點(diǎn)是必不可少的。Rm Man134A–M4 的結(jié)構(gòu)表明,甘露四糖結(jié)合+1至+4子位點(diǎn),因此Rm Man134A無法水解聚合度 ≤4的甘露寡糖。通過合理的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì),顯著提升了RmMan134A的比活力和最佳條件。本文旨在研究真菌 GH 134家族的β-1,4-甘露聚糖酶的結(jié)構(gòu)和功能,以及GH134家族成員與底物結(jié)合機(jī)制。

本文主要研究結(jié)果:

(1)解析了真菌中GH134家族的β-1,4-甘露聚糖酶(Rm Man134A)的結(jié)構(gòu)。

(2)研究了Rm Man134A對(duì)不同底物的催化效率。

(3)提出了GH134家族成員與底物的結(jié)合機(jī)制。

(4)在結(jié)構(gòu)上解釋了Rm Man134A 的底物特異性。