文章背景簡介

耐熱的漢遜酵母Ogataea polymorpha是一種具有基礎(chǔ)研究和應(yīng)用價(jià)值的微生物。它已成為研究甲醇利用、細(xì)胞自噬、硝酸同化的重要有機(jī)體。它的一個(gè)吸引人的特性是能夠通過非同源末端連接（NHEJ）將多達(dá)100個(gè)目標(biāo)拷貝基因整合到基因組中。此外，它可以利用人體低聚糖合成糖蛋白，還可以在高達(dá)50℃的溫度下生長，從而可降低工業(yè)發(fā)酵昂貴的冷卻成本。

CRISPER－Cas9輔助基因組編輯技術(shù)的研究進(jìn)展為建立多重基因組工程提供了一種有效的途徑。其基本原理是：反式激活crRNA：crRN雙鏈直接引導(dǎo)Cas9蛋白與目標(biāo)DNA序列結(jié)合，然后Cas9蛋白在PAM上游的三個(gè)核苷酸中產(chǎn)生雙鏈斷裂（DSB）。DSB可以通過非同源末端連接插入或修復(fù)，也可以通過同源重組來進(jìn)行精準(zhǔn)編輯，如基因敲除，點(diǎn)突變等。

核糖體DNA（rDNA）是編碼核糖體RNA的DNA序列。在酵母中，rDNA通常由大量的相同重復(fù)序列組成。在O． polymorpha中，rDNA包含50－60個(gè)8kb的重復(fù)單元。在釀酒酵母（S． cerevisiae）中，rDNA位點(diǎn)由150－200個(gè)重復(fù)序列組成，重復(fù)序列為9．1kb。近年來，rDNA重復(fù)序列已成為一些酵母菌多拷貝基因整合的目標(biāo)位點(diǎn)。

2018年6月，中國科學(xué)院微生物學(xué)研究所病原微生物學(xué)與免疫學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室的Laiyou Wang等人，在《Biotechnology for Biofuels》雜志（IF2018＝5．497；工程技術(shù) 1區(qū)）發(fā)表了題為“Efficient CRISPR－Cas9 mediated multiplex genome editing in yeasts”的文章。

所用到的主要方法

1．活細(xì)胞的制備及轉(zhuǎn)化

2．質(zhì)粒構(gòu)建和模板編輯

3．編輯效率計(jì)算：

編輯效率＝所需突變體數(shù)目／總被測菌落數(shù)

4．流式細(xì)胞儀分析

5．基因拷貝數(shù)估計(jì)

6．穩(wěn)定性檢測

7．搖瓶發(fā)酵

8．產(chǎn)品濃度分析：HPLC

文章主要內(nèi)容摘要

在本研究中，作者發(fā)展了一種CRISPR－Cas9輔助多重基因組編輯（CRISPR–Cas9－assisted multiplex genome editing，CMGE）方法，包括多重基因敲除、多位點(diǎn)（ML）和多拷貝（MC）整合方法。在CMGE的基礎(chǔ)上，對(duì)漢遜酵母（O．polymorpha）進(jìn)行了基因敲除、整合和精確點(diǎn)突變等基因組修飾。采用CMGE－ML整合方法，在白藜蘆醇生物合成途徑三個(gè)不同的位點(diǎn)同時(shí)整合 橙色滑柱菌（Herpetosiphon aurantiacus）的酪氨酸解氨酶（TAL）基因，擬南芥的4－香豆酰CoA連接酶（4CL）基因和釀酒葡萄的芪合酶（STS）基因，成功實(shí)現(xiàn)白藜蘆醇在O． polymorpha內(nèi)的生物合成。采用CMGE－MC方法，將不同拷貝數(shù)的融合基因表達(dá)盒Psctef1－TAL－Psctpi1－4CL－Psctef2－STS整合到基因組中，白藜蘆醇產(chǎn)量比單拷貝整合提高了20倍，達(dá)到97．23±4．84 mg／L。此外，本研究還利用CMGE－MC技術(shù)分別整合了人血清白蛋白（HSA）和大腸桿菌賴氨酸脫羧酶（cadA）基因，實(shí)現(xiàn)了人血清白蛋白和尸胺的生物合成。除漢遜酵母外，本研究還在釀酒酵母內(nèi)也成功地建立了 CMGE－MC方法。CMGE方法為O． polymorpha和其他酵母的基因工程和合成生物學(xué)研究提供了一個(gè)有效的工具。

在釀酒酵母中同步敲除多基因的CRISPR－Cas系統(tǒng)