前言

抗體偶聯(lián)藥物（ADC）在過去幾年中取得了巨大的發(fā)展勢頭，十多種ADC藥物被監(jiān)管機構批準用于臨床癌癥治療。目前人們著重于開發(fā)特定位點的偶聯(lián)方法，通過引入特異性氨基酸或非天然氨基酸殘基、肽和聚糖，通過抗體工程實現(xiàn)選擇性抗體偶聯(lián)。

除了使用合成細胞毒素外，這些新方法還被應用于偶聯(lián)其他有效載荷，如非細胞毒性化合物、蛋白質/肽、聚糖、脂質和核酸。非細胞毒性化合物包括聚乙二醇、抗生素、蛋白質降解劑（PROTAC和LYTAC）、免疫調(diào)節(jié)劑、酶抑制劑和蛋白質配體。不同的小分子蛋白或多肽已經(jīng)可以通過非天然氨基酸使用點擊化學、C-末端工程化甲�；�甘氨酸以及酶或無酶特異性轉肽反應偶聯(lián)。這些含有新型有效載荷的位點特異性抗體偶聯(lián)藥物（AXC）正處于概念驗證和臨床前開發(fā)階段，將可能產(chǎn)生新的治療方法，以解決目前未滿足的醫(yī)療需求。

位點特異性抗體偶聯(lián)

位點特異性抗體偶聯(lián)始于單克隆抗體的工程化或修飾，然后是優(yōu)化的藥物連接子的綴合�？贵w通過IgG的Fab或Fc區(qū)進行工程設計，通過使用基因工程、代謝標記或化學酶修飾引入不同的結合位點。

 位點特異性抗體偶聯(lián)可以通過基因工程引入特定的位點，例如半胱氨酸（Cys）、谷氨酰胺（Gln）、非天然氨基酸（對乙酰苯丙氨酸和對疊氮甲基-L-苯丙氨酸）或短肽標簽。通過Cys的偶聯(lián)相對簡單直接，不需要特殊的試劑或酶。THOMABTM是通過工程化Cys進行的位點特異性偶聯(lián)，是正在開發(fā)的首批位點特異性抗體-藥物偶聯(lián)方法之一。在動物模型中，使用這種方法產(chǎn)生的ADC不僅表現(xiàn)出高度均質性，而且在體內(nèi)表現(xiàn)出更高的療效和治療指數(shù)。

此外，位點特異性偶聯(lián)也可以通過使用包括轉谷氨酰胺酶、轉肽酶/分選酶、糖基轉移酶或內(nèi)糖苷酶在內(nèi)的多種酶的化學修飾方法來完成。特異性短肽標簽內(nèi)氨基酸的酶修飾產(chǎn)生的抗體偶聯(lián)藥物具有高選擇性和穩(wěn)定性，然而其引入的肽標簽的潛在免疫原性目前尚不清楚。目前，通過工程化Cys、非天然氨基酸和酶聚糖重塑的位點特異性偶聯(lián)已經(jīng)大規(guī)模進行，并且產(chǎn)生的多個抗體偶聯(lián)藥物正在臨床試驗中進行測試。

非細胞毒性化合物有效載荷

目前，有幾種非細胞毒性化合物用于位點特異性偶聯(lián)，如聚乙二醇（PEG）、抗生素、免疫調(diào)節(jié)化合物、蛋白質降解劑以及在癌癥中過表達的受體和蛋白質的配體。

PEG

為了延長抗體片段的半衰期，20多年前首次描述了Fab通過鉸鏈Cys殘基的PEG化。由于PEG的附著點遠離表位結合區(qū)，因此與未修飾的Fab相比，PEG化的Fab的抗原結合和體外生物活性通常不會降低。聚乙二醇化也不影響穩(wěn)定性，而抗體片段的半衰期可以顯著增加。聚乙二醇化抗TNF Fab，Certolizumab pegol，已被監(jiān)管機構批準用于治療免疫介導的炎癥性疾病患者，而其他聚乙二醇化Fab也正在進行臨床前和臨床開發(fā)。

抗生素

一種新型抗體-抗生素偶聯(lián)物（AAC）正在開發(fā)，作為一種潛在的治療方法可有效殺死細胞內(nèi)細菌。使用THIOMATM方法，將一種只有在溶酶體中釋放后才被激活的高效抗生素rifalogue與抗金黃色葡萄菌抗體輕鏈上的V205C位點特異性偶聯(lián)。AAC在體內(nèi)治療菌血癥和消除細胞內(nèi)金黃色葡萄球菌感染方面優(yōu)于萬古霉素。AAC提供了一種針對細胞內(nèi)細菌感染的獨特治療方法，目前正在臨床開發(fā)中（NCT03162250）。

免疫調(diào)節(jié)化合物

合成的非細胞毒性酶抑制劑或特異性受體的配體已通過與抗體位點特異性偶聯(lián)，用于免疫調(diào)節(jié)。如磷酸二酯酶4（PDE4）的酶抑制劑，將高效PDE4抑制劑與抗CD11a抗體偶聯(lián)，免疫偶聯(lián)藥物迅速內(nèi)化入免疫細胞，并抑制脂多糖誘導的原代人單核細胞分泌TNF-α。其在小鼠模型中顯示出體內(nèi)抗炎作用。

此外，基于幾種肝X受體（LXR）激動劑誘導膽固醇反向轉運和抗炎的能力，將LXR激動劑與抗CD11a抗體偶聯(lián)，單核細胞CD11a表達的增加已被發(fā)現(xiàn)與動脈粥樣硬化性冠狀動脈狹窄相關。該偶聯(lián)藥物具有對溶酶體組織蛋白酶B敏感的可裂解接頭，免疫偶聯(lián)物在體外特異性誘導人THP-1單核細胞和巨噬細胞中的LXR激活，而在肝細胞中沒有顯著作用。

蛋白降解劑有效載荷

近年來，位點特異性抗體偶聯(lián)被應用于蛋白質降解領域。蛋白水解靶向嵌合體（PROTAC）依賴于合成的嵌合分子通過蛋白酶體在細胞內(nèi)降解蛋白質靶標。PROTAC在藥物發(fā)現(xiàn)中的應用在過去十年中取得了重大進展，然而，依然存在一些挑戰(zhàn)，如溶解度和體內(nèi)藥代動力學。使用PROTAC位點特異性抗體偶聯(lián)，可能會提供一些更優(yōu)的替代方法。

例如，一些PROTAC化合物已被鑒定用于降解含溴結構域的蛋白質-4（BRD4），然而在小鼠靜脈或口服給藥后，表現(xiàn)出不利的理化特性和較差的體內(nèi)藥代動力學。因此，通過甲硫磺�；鵆ys偶聯(lián)，將這些PROTAC偶聯(lián)到抗C型凝集素樣分子-1（CLL1）的抗體上，該抗體經(jīng)工程化改造具有三個不成對的半胱氨酸殘基（LC-K149C、HC-L174C和HC-Y373C），每個抗體可能連接六個PROTAC（DAR為~6）。在攜帶HL-60（急性髓細胞白血�。┘毎�異種移植物的小鼠中，單次靜脈注射抗體-PROTAC偶聯(lián)藥物可產(chǎn)生劑量依賴性的腫瘤生長抑制。此外除了PROTAC，位點特異性偶聯(lián)也被應用于溶酶體靶向嵌合體（LYTAC）。

蛋白質和多肽的有效載荷

目前，蛋白質或多肽也已被用于位點特異性抗體偶聯(lián)。例如，一種新的抗體-唾液酸酶偶聯(lián)藥物，在抗HER2抗體重鏈的C末端附近引入短肽標簽LCTPSR通過酶反應生成疊氮化物，然后通過點擊化學將含疊氮化物的抗體偶聯(lián)到唾液酸酶上。抗體唾液酸酶偶聯(lián)藥物對HER2陽性癌癥細胞的ADCC活性增強�；钚栽黾优c癌癥細胞脫乙�；�、自然殺傷細胞（NK）與抑制性Siglec受體的結合減少以及與NKG2D的結合增強有關。

此外，也有研究探索抗體與癌癥中過表達蛋白質的配體位點特異性偶聯(lián)。例如，將抗CD3 Fab或scFv偶聯(lián)到這些配體上以產(chǎn)生雙特異性T細胞接合器。在一項研究中，一種非天然氨基酸pAcF被摻入抗CD3 Fab的兩個不同位置（LC-S202和HC-K138），將工程化Fab與前列腺特異性膜抗原（PSMA）的合成高親和力配體偶聯(lián)。該雙特異性T細胞接合器在體外對前列腺癌癥細胞株表現(xiàn)出強大的細胞毒性，在體內(nèi)也表現(xiàn)出良好的抗癌效果。

AMG133是抗GIPR抗體與GLP-1多肽的偶聯(lián)藥物，AMG133分子中抗體偶聯(lián)的GLP-1多肽分子經(jīng)過改造，在多肽的第8位和第22位引入非天然氨基酸Aib，增加了多肽部分的血漿穩(wěn)定性和半衰期�？贵w分子的重鏈引入了E384C位點突變，通過cys的巰基將多肽偶聯(lián)至抗體重鏈Fc區(qū)域。其在肥胖患者的1期臨床試驗中顯示出卓越的減重藥效。

核酸有效載荷

siRNA是一種21-25核苷酸的雙鏈復合物，在誘導特定mRNA的降解和抑制其翻譯方面具有高度選擇性。為了增強特異性組織或細胞遞送，已經(jīng)做出了許多努力來開發(fā)位點特異性偶聯(lián)方法，以產(chǎn)生抗體-siRNA偶聯(lián)藥物（ARC）。

Song等人首先研究了使用非共價復合物遞送siRNA的方法。使用重組方法將來自抗gp160（HIV包膜）Fab片段的重鏈的C末端與魚精蛋白融合，魚精蛋白含有許多與DNA相互作用的帶正電荷的氨基酸殘基。然后將來自Fab-魚精蛋白融合物與siRNA雜交，siRNA可以被遞送并沉默HIV-1包膜細胞中的基因表達，并抑制HIV在T細胞中的復制。與魚精蛋白融合的HER2單鏈抗體也能將siRNA特異性地傳遞到HER2陽性的乳腺癌癥細胞中。

此外，siRNA也可以與抗體中特定位點進行直接偶聯(lián)。Cuellar等人首次報道了使用THIOMBTM方法將抗體與siRNA直接偶聯(lián)。他們選擇了七個針對不同內(nèi)化程度靶點的抗體，這些抗體在重鏈（A118C）或輕鏈（V205C）中引入了不成對的Cys，然后和其他幾個基因特異性的siRNA偶聯(lián)。在體外測試的ARC中，在表達高抗原水平的細胞中，兩種表現(xiàn)出中度基因沉默（≤50%沉默），一種（抗TENB2-siRNA偶聯(lián)藥物）表現(xiàn)出最高沉默（>50%）。

目前，抗體-寡核苷酸偶聯(lián)藥物已開始進入臨床。幾家生物技術公司針對許多不同的適應癥進行試驗，包括罕見病、中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病和癌癥。這些位點特異性抗體-寡核苷酸偶聯(lián)藥物為未來許多未滿足的醫(yī)療需求創(chuàng)造了巨大的機會。

小結

作為下一代方法，位點特異性抗體偶聯(lián)為生產(chǎn)具有改善治療指數(shù)的同質ADC提供了巨大的潛力。隨著抗體工程方法的不斷進步，許多新方法已經(jīng)被開發(fā)出來。它們已被應用于偶聯(lián)許多不同的有效載荷，包括非細胞毒性化合物、小蛋白/肽和siRNA，而不僅僅是ADC的合成細胞毒素。這些獨特的抗體偶聯(lián)物擁有巨大的潛力開發(fā)針對不同疾病的新療法，造�；颊摺�

參考文獻：

1.Site-Specific Antibody Conjugation with Payloads beyond Cytotoxins. Molecules. 2023 Jan 17;28(3):917

       原文標題 : 位點特異性AXC新型有效載荷