前言

腫瘤壞死因子受體超家族（TNFRSF）是一個龐大而重要的免疫調節(jié)家族，為許多免疫效應細胞提供關鍵的共刺激信號。每一個共刺激TNFRSF成員在不同類型的細胞和免疫反應的不同階段都有不同的表達譜和獨特的功能影響。利用TNFRSF介導的信號傳導進行腫瘤免疫治療已成為一個重要的領域。

嵌合抗原受體（CAR）－T細胞治療可能是過去十年免疫治療中最重大的突破，隨著CAR－T細胞技術越來越成熟，CAR結構的組成，特別是細胞內(nèi)結構域也在不斷進化。第一代（G1）CAR－T細胞結構包含腫瘤相關抗原的高親和力單鏈抗體（scFv）、跨膜結構域和唯一的細胞內(nèi)TCR－ζ或FcR－γ結構域。G1 的臨床益處有限，主要是由于其增殖能力低和體內(nèi)細胞毒性有限。為了克服這一缺點，第二代（G2）CAR結構配備了額外的細胞內(nèi)共刺激結構域，最顯著的是CD28或TNFRSF成員4－1BB。這些G2 CARs被證明是非常有效的，幾種CAR－T產(chǎn)品在治療血液瘤方面獲得了監(jiān)管部門的批準。

第三代（G3）CAR－T結構包含了共刺激結構域的組合，而第四代（G4）和第五代（G5）CAR－T細胞包含額外的共刺激結構域，在抗原識別時誘導表達細胞因子（例如IL－12），或包含某些細胞因子受體的細胞內(nèi)結構域（例如，截短的IL－2受體β鏈和STAT3結合部分）。在此，我們來一起回顧了TNFRSF的細胞內(nèi)共刺激結構域在增強和調節(jié)CAR－T細胞活性方面的應用。

4－1BB的共刺激結構域

4－1BB是一種關鍵的共刺激受體，在TCR－MHC相互作用時的T細胞上快速上調。其配體4－1BBL在抗原呈遞細胞（如巨噬細胞和樹突狀細胞）上表達。4－1BBL與4－1BB的結合導致TRAF1、TRAF2和TRAF3向4－1BB的胞內(nèi)結構域募集。隨后，形成了包含多種蛋白質（包括激酶和泛素連接酶）的4－1BB信號復合體，并最終啟動關鍵信號通路，如NF－kB和PI3K－AKT。最終，4－1BB信號誘導細胞毒性T細胞的增殖、促炎細胞因子的分泌以及效應和記憶T細胞（Tm）的擴增。

4－1BB的細胞質信號結構域是CAR－T細胞結構中應用最早、探索最多的TNFRSF成員。與CD28 CAR－T細胞相比，4－1BB共刺激產(chǎn)生具有明顯代謝特征的CAR－T細胞，如T細胞表面GLUT1表達減少和線粒體呼吸增加。這些差異也反映在CAR－T細胞表型和功能上。例如，CD19靶向CAR－T細胞中的4－1BB共刺激在小鼠模型中產(chǎn)生了更有效的B－ALL清除，并且4－1BB CAR－T比CD28共刺激的CAR－T細胞持續(xù)時間更長。

目前，共有三種使用了4－1BB的CAR－T細胞產(chǎn)品，即Tisagenelecluel（Kymriah）、Liscabatagene－Maraluel（BREYANZI）和Idecabatgene－Vicluel（ABECMA），已獲得FDA批準。Tisagenlecleucel是一種CD19靶向G2 CAR－T細胞，在93例DLBCL患者進行的臨床試驗中，其產(chǎn)生了強大的藥效（52％，ORR；40％，CR；12％，PR）。此外，觀察到強烈但可控的3級或4級副作用，如89．7％的患者出現(xiàn)可逆性細胞因子釋放綜合征（CRS），9名患者出現(xiàn)可逆性神經(jīng)精神事件（31％）。

Liscabatagene－Maraluel是另一種CD19靶向的G2 CAR－T細胞產(chǎn)品，含有4－1BB結構域，額外表達表皮生長因子受體（EGFR）的截斷版本。這種設計考慮到安全性，在需要時，可以使用Cetuximab清除CAR－T細胞。在對256例復發(fā)或難治性大B細胞淋巴瘤患者進行的臨床試驗中，其ORR和CR分別為73％ 和53％。

第三種4－1BB CAR－T細胞產(chǎn)品IdecabtageneVicluel是FDA批準的第一種治療多發(fā)性骨髓瘤的CAR－T細胞療法，其靶向多發(fā)性骨髓瘤細胞上表達的B細胞成熟抗原（BCMA）。在難治性和復發(fā)性多發(fā)性骨髓瘤（rrMM）患者中的II期臨床試驗中，其ORR為73％，CR達到33％，26％的患者達到了最小殘留病灶（MRD）陰性狀態(tài)。此外，在另一項3期研究（NCT03651128）中，與標準治療相比，Idecabtagene顯著改善了ORR（76．4％ vs 32．2％）、PFS（11．6vs 3．5個月）和OS（20．2 vs 14．7個月）。

為了將T細胞效應器功能與T細胞記憶誘導結合起來，并實現(xiàn)更持久的臨床反應，已經(jīng)開發(fā)出包含CD28和4－1BB共刺激結構域的G3CAR－T結構。與G2 CAR－T細胞相比，G3 CAR－T細胞的治療觸發(fā)了重要細胞內(nèi)信號分子（如LAT、ZAP－70、SYK和ERK）的更多磷酸化。因此，G3 CAR－T細胞產(chǎn)生更多的IL－2，具有更高的增殖能力和更好的體內(nèi)持久性。

幾項研究探索了4－1BB G3 CAR－T細胞的臨床應用，在四名復發(fā)性惰性B細胞或套細胞淋巴瘤（MCL）患者中進行了一項小型試驗，以測試針對靶向CD20的CD28和4－1BB G3CAR－T細胞的安全性，該試驗證明其總體上安全且耐受性良好。值得注意的是，其中2名患者CR，并且在12個月和24個月內(nèi)沒有進展，即使在輸注后1年，血液中也能檢測到CAR－T細胞。此外，針對其他靶點的G3 CAR－T細胞也進行了評估。例如，前列腺癌靶抗原（PSMA）G3 CD28和4－1BB CAR－T細胞也顯示出強大的抗腫瘤活性。

總之，在CAR－T細胞結構中加入4－1BB共刺激結構域可改善CAR－T細胞的體內(nèi)持久性，增強記憶形成，并降低耗竭標記物的表達。在結合4－1BB和CD28共刺激的G3 CAR－T細胞構建中，與G2 CAR－T細胞相比，獲得了更高的增殖能力和更好的體內(nèi)持久性。并且迄今為止發(fā)現(xiàn)CD28和4－1BB G3 CAR－T細胞安全且耐受性良好。然而，考慮到CAR－T細胞應用中的某些共刺激結構域用于治療特定類型的癌癥，因此，在得出明確結論之前應小心謹慎。

OX40的共刺激結構域

另一個被探索作為CAR－T細胞共刺激劑的TNFRSF成員是OX40。OX40僅在MHC－TCR參與時在T細胞上上調，OX40信號增加T細胞的持久性并誘導記憶性T細胞（Tm）的形成。OX40信號還觸發(fā)克隆擴增并上調抗凋亡蛋白的表達，如Bcl－2、Bcl－xL和Bfl－1，從而促進活化T細胞的存活。

OX40和4－1BB在功能上有許多相似之處，但它們在調節(jié)CD4＋和CD8＋T細胞反應方面存在明顯的活性差異。OX40和4－1BB實際上在腺病毒感染時調節(jié)CD8＋ T細胞克隆擴增方面具有相反的作用，OX40缺陷的CD8＋T細胞顯示CD8＋T細胞擴增減少，而4－1BB缺陷的CD8＋T細胞實際上表現(xiàn)出高反應性，導致CD8＋T細胞數(shù)量增加。此外，T細胞分化為功能性效應細胞需要OX40，而4－1BB導致啟動早期分化水平降低。

與CD28 G2 CAR－T相比，OX40G2 CAR－T細胞產(chǎn)生更多IFN－γ、同等水平的IL－2和類似的CAR－T細胞增殖反應。更重要的是，OX40 G2 CAR－T細胞產(chǎn)生的IL－10水平顯著降低。相應地，與CD28 G2 CAR－T細胞相比，針對癌胚抗原（CEA）的G3 CAR－T細胞中CD28與OX40的聯(lián)合刺激降低了IL－10的水平，并阻止了CAR－T細胞的自動抑制。此外，CD28／OX40共刺激使CAR－T細胞在重復抗原結合時免于激活誘導的細胞死亡。

許多早期證據(jù)表明OX40是一種很有希望用于CAR－T細胞的共刺激結構域。它能防止自身抑制，拯救活化誘導的細胞死亡，以及優(yōu)越的細胞毒性活性。目前，靶向雙唾液酸神經(jīng)節(jié)苷脂（GD2）陽性實體癌（如黑色素瘤、神經(jīng)母細胞瘤、骨肉瘤和一些其他肉瘤）的CD28／OX40CAR－T細胞是正在治療轉移性黑色素瘤的臨床試驗（NCT02107963）中進行評估。

CD27的共刺激結構域

CD27的表達存在于CD4＋和CD8＋T細胞、NK細胞和啟動的B細胞上。CD27的配體CD70在抗原呈遞細胞上表達，包括DC和巨噬細胞。在激活T細胞上的CD27后，下游信號通過NF－κB誘導激活，導致T細胞活化、分化和克隆擴增。

與G1 CAR T細胞相比，在SKOV3人卵巢癌細胞－小鼠模型中，CD27 G2 CAR－T細胞具有增強的抗原刺激效應器功能、上調抗凋亡蛋白的表達、增強的體內(nèi)持久性和增強的腫瘤消退。在該模型中，CD27 G2 CAR－T細胞和4－1BB或CD28 G2 CAR－T細胞之間未觀察到差異。然而，與CD28介導的共刺激相比，CD27共刺激增強了CAR－T細胞的持久性。

臨床上，在34例神經(jīng)母細胞瘤患者中，以GD2為靶向的CD27／CD28 CAR－T細胞治療產(chǎn)生15％的PR和38％的SD，一年生存率為74％。在另一項最近關于CD27／CD28 CAR－T細胞的臨床研究中，CLL1靶向CAR－T細胞在AML患者中被證明是安全的。令人印象深刻的是，在這項研究的四名患者有3名顯示CR，MRD陰性，可以繼續(xù)進行造血干細胞移植（HSCT）。這些患者的副作用僅限于1至2級CRS。

值得注意的是，激活CD27也可誘導CD8＋T細胞的終末分化、耗竭和凋亡。事實上，IL13Rα2靶向的G2 4－1BB CAR－T細胞表面組成性表達的CD27分子大大減少了CAR－T細胞的增殖，并誘導其耗竭和凋亡。

總之，CD27介導的共刺激可以增強不同的CAR－T細胞特征，如CAR－T細胞的持久性和細胞毒性。臨床上，CD27／CD28共刺激組合在神經(jīng)母細胞瘤、AML和淋巴瘤患者中產(chǎn)生了令人印象深刻的反應。然而，在CAR－T細胞結構中，CD27和其他共刺激分子的組合也應仔細考慮，以避免終末分化和耗竭。

CD40的共刺激結構域

CD40在髓源性抗原呈遞細胞上表達，如樹突狀細胞（DC）、粒細胞和巨噬細胞。CD40配體（CD40L）主要在活化的T細胞和NK細胞上表達。在APC上，CD40與CD40L的結合激活抗原呈遞和共刺激信號，從而促進細胞毒性T細胞的激活和擴增。

在最初的研究中，無論是G2型還是帶有CD28結構域的G3型，CD40或4－1BB CAR－T細胞之間的抗原特異性靶細胞殺傷均未觀察到差異。然而，與4－1BB共刺激相比，CD40共刺激確實觸發(fā)了更強的NF－κB激活。

為了增強共刺激信號，CD40 CAR－T細胞已與CAR結構中的其他共刺激分子結合，例如與B細胞信號部分的CD79A結合，這兩種受體都激活下游的NF－κB、NFAT和AP－1信號。與CD28或4－1BB共刺激的CAR－T細胞相比，CD79A／CD40CAR－T細胞在體外與CD19表達細胞共培養(yǎng)時，NF－κB和p38活性升高，增殖更多。在接種Raji腫瘤細胞的小鼠中，與CD28或4－1BB共刺激的CAR－T細胞相比，CD79A／CD40共刺激的CAR－T細胞也具有更好的抗腫瘤活性和增殖活性。

HEVM和GITR的共刺激結構域

HVEM和GITR最近也被納入到CAR－T細胞結構中。HVEM具有免疫刺激和免疫抑制功能，并與配體CD160、BTLA、LIGHT和LTα相互作用。HVEM在各種免疫細胞上表達，包括T細胞、B細胞、NK細胞和樹突狀細胞。HVEM與LIGHT或LTα的結合導致T細胞活化和增殖，而HVEM與T細胞表達的BTLA的結合抑制T細胞活化。此外，HVEM還調節(jié)CD8＋T細胞的效應器和記憶形成。

到目前為止，HVEM作為CAR－T細胞的共刺激結構域僅被報道過一次，與對照CD28或4－1BB G2 CAR－T細胞相比，HVEM G2 CAR－T細胞表現(xiàn)出增強的抗腫瘤細胞毒性和促炎細胞因子生成，例如IL－2、TNF－α和IFN－γ。此外，HVEMG2 CAR－T細胞中的CAR－T耗竭降低，并且檢測到Tcm和Tem細胞的等效百分比。相比之下，在CD28和4－1BB CAR－T細胞中，Tem和Tcm亞群分別高度富集。因此，HVEM G2 CAR－T細胞似乎產(chǎn)生了更平衡的CAR－T細胞表型。有趣的是，在體外的HVEM CAR－T細胞中檢測到糖酵解和線粒體呼吸水平增強。因此，HVEM共刺激似乎增加了能量代謝，這一特征與T細胞耗竭減少正相關。

CAR－T共刺激域的另一個TNFRSF成員是GITR。與4－1BB或OX40不同，GITR在T細胞上呈組成性表達，在CD4／CD25／Foxp3陽性Treg上的表達高于幼稚或記憶性T細胞。此外，在TCR激活后，效應T細胞上GITR的表達上調。GITR激動劑抑制Treg的抑制活性并提高效應T細胞的存活率。

在EGFR靶向的CAR－T細胞中，GITR共刺激產(chǎn)生的抗腫瘤活性與各種腫瘤細胞系中CD28或4－1BB G2 CAR－T細胞相當，甚至更強。靶向CD19的GITR G2 CAR－T細胞在體內(nèi)也顯著抑制了Raji腫瘤細胞的生長。此外，與共刺激CAR－T結構域DAP－10、CD28、4－1BB、ICOS和OX40相比，GITR共刺激在T細胞淋巴瘤和黑色素瘤模型體內(nèi)表現(xiàn)出更強的細胞毒性。然而，與CD28 CAR－T細胞相比，GITR共刺激確實減少了TNF－α、IL－2和Th17相關細胞因子的分泌，并誘導了更分化的效應器表型，同時降低了體內(nèi)持久性。

總結與展望

在CAR－T細胞中添加的各種TNFRSF成員的共刺激域中，不同的TNFRSF成員之間具有明顯優(yōu)勢和劣勢。顯然，通過選擇和／或組合不同的共刺激域，可以極大地影響和驅動CAR－T細胞的效果。

在這方面，在最近的比較中，臨床產(chǎn)品中通常使用的CD28和4－1BB共刺激結構域明顯優(yōu)于其它共刺激結構域，包括OX40、ICOS或CD27。因此，進一步工程化CAR－T細胞的細胞內(nèi)結構域可能產(chǎn)生增強的功能。例如，OX40共刺激結構域類似于4－1BB，可用于增強CAR－T細胞的持久性，但與CD28共刺激結構域相比，其對效應器功能的激活減少。GITR共刺激結構域可用于驅動效應器功能，但與CD28一樣，與持久性降低有關。此外，在激發(fā)持久的抗癌反應方面，OX40共刺激被證明優(yōu)于4－1BB共刺激，而CD40 CAR－T細胞似乎對內(nèi)源性免疫也有強烈的刺激作用。

特別是，G3或G4 CAR－T細胞中不同共刺激結構域的組合可能產(chǎn)生額外的臨床益處，因為不同的CAR－T細胞功能可以組合以產(chǎn)生協(xié)同活性。例如，通過結合CD28和OX40共刺激結構域，早期效應器表型與持久性和持久性抗腫瘤反應相結合，優(yōu)于CD28／4－1BB結合的CAR－T細胞。在另一種G3 CAR－T細胞方法中，CD28分別結合4－1BB和CD40的共刺激，后者顯示出最有效的共刺激效應。

此外，除了確定要選擇CAR－T細胞結構中TNFRSF家族的哪個成員外，還應注意ICD結構域的順序、要選擇哪個跨膜結構域以及鉸鏈／間隔區(qū)的設計。共刺激域在CAR結構中的定位可以極大地影響CAR－T細胞的功能，并決定是否可以從共刺激域獲得額外的益處。

最后，還要考慮TME的影響。最近的研究表明，用環(huán)磷酰胺預處理可有效地修飾免疫抑制性TME，從而在轉移性前列腺癌和胰腺癌模型中產(chǎn)生靶向PSCA的4－1BB CAR－T細胞的持久治療反應。此外，調節(jié)CAR－T也可能有助于修飾TME，OX40 G2 CAR－T細胞產(chǎn)生的抗炎分子IL－10水平明顯低于CD28 G2 CAR－T細胞。與CD28 G2 CAR－T細胞相比，G3 CAR－T細胞中的CD28聯(lián)合OX40刺激也降低了IL－10水平，并阻止了CAR－T細胞的自動抑制。因此，CD28和OX40聯(lián)合刺激可能適用于靶向免疫抑制TME的CAR－T細胞。

不同TNFRSF成員的不同作用仍在探索中，我們對這一獨特家族的理解可能還存在差距。盡管如此，這些成員的全部潛力被釋放只是時間問題，無論是單獨還是與其他TNFRSF成員聯(lián)合使用。很明顯毫無疑問，在下一代CAR－T細胞中，TNFRSF成員將繼續(xù)發(fā)揮核心、多樣和重要的作用。

參考文獻：

1． The Implementation of TNFRSF Co－StimulatoryDomains in CAR－T Cells for Optimal Functional Activity． Cancers （Basel）． 2022Jan； 14（2）： 299．

       原文標題 : 聊一聊CAR-T細胞中的共刺激域