前言

斑馬魚（Danio rerio）因其條紋而得名，是一種小型熱帶魚，主要生活在南亞地區(qū)的河流中。40多年前，斑馬魚作為發(fā)育生物學研究的模式生物進入實驗室。斑馬魚是實現(xiàn)這一目的的理想選擇，因為它們是體外受精的，可以從一對繁殖體中生成數(shù)百個胚胎，并且是透明的，能夠觀察脊椎動物從單個細胞到器官發(fā)生的全過程。

此外，斑馬魚與人類共享70％的基因組，80％以上的疾病蛋白是保守的。至關重要的是，斑馬魚模擬的疾病往往代表了真正的人類疾病模型，現(xiàn)在已成為人類疾病強大的研究工具，斑馬魚模型已廣泛用于癌癥、肝病、血液病、心臟病和行為障礙等。

斑馬魚表現(xiàn)藥物篩選優(yōu)勢

藥物發(fā)現(xiàn)的一個基本挑戰(zhàn)是顯示療效和了解整個活體動物系統(tǒng)內的作用機制。盡管許多化合物和藥物先導物在體外或細胞系統(tǒng)中具有活性，但了解藥物在器官、組織和身體遠端部位的疾病背景下如何發(fā)揮作用至關重要。斑馬魚模型在這方面具有獨特的優(yōu)勢。

凸顯表型特征

斑馬魚是表型藥物發(fā)現(xiàn)的優(yōu)良模型系統(tǒng)。在表型藥物篩選中，先導藥物是根據(jù)其產生表型結果的潛力來選擇的，與已知和驗證的靶點無關。表型藥物篩選過程的固有特征包括：即使藥物通過靶向多個靶點產生預期的表型結果，例如激酶抑制劑可以通過靶向多個激酶產生治療益處，也可以識別藥物或先導藥物；有可能產生廣泛的表型結果；針對化合物的反篩選可用于了解其他毒性或不想要的表型。

斑馬魚胚胎的小尺寸意味著可以在活動物中篩選數(shù)千個胚胎的表型效應。雖然表型斑馬魚篩選的通量不如細胞培養(yǎng)、酵母、果蠅或體外活性測定中的高，但斑馬魚胚胎的篩選規(guī)模超過了目前可用的其他脊椎動物系統(tǒng)。

此外，對于一些藥物，斑馬魚比小鼠模型更好地再現(xiàn)了在人類身上看到的效果。沙利度胺就是這種情況。在小鼠中，沙利度胺沒有引起任何缺陷；然而，在斑馬魚中，沙利度胺會導致與人類相同的肢體形態(tài)缺陷。

體現(xiàn)整合的生理學

斑馬魚幾乎具有與人類相同的組織發(fā)育和穩(wěn)態(tài)，包括血液、肌肉、心臟、肝臟、胰腺、脾臟、腸道、腎臟、骨骼、脂肪以及神經元和神經嵴的發(fā)育�？梢院Y選藥物在組織中的靶向活性，同時提供有關化合物吸收、分布、代謝、排泄和毒性特性的信息。

這種優(yōu)勢提供了有關藥物或藥物組合常見副作用的重要信息。例如，阿霉素是一種拓撲異構酶II抑制劑，對殺死癌細胞非常有效，但具有心臟毒性和心力衰竭的巨大風險；在用這種藥物治療的斑馬魚身上也觀察到了同樣的心臟毒性。通過篩選能夠預防阿霉素誘導的心肌病的輔助療法，發(fā)現(xiàn)了天然產物visnagin，它可以在不改變阿霉素對癌細胞的細胞毒性的情況下預防心肌病。

最近，這種整合生理學的潛力得到了進一步開發(fā)，使用斑馬魚來識別能夠抵抗順鉑劑量限制毒性的化合物，順鉑是一種常見的廣譜化療藥物，可導致腎損傷和耳聾。通過對腎臟和側線細胞同時進行毒性篩選試驗，發(fā)現(xiàn)多巴胺及其相關調節(jié)因子具有耳和腎保護作用，而不影響順鉑誘導癌細胞死亡的效力。

篩選試驗

斑馬魚篩選試驗能夠以單細胞分辨率對器官和組織上的藥物活性進行深度表型分析。廣泛的篩選使用了捕捉發(fā)育生物學、細胞增殖、癌癥、感染和免疫、行為和毒性等動態(tài)的分析。

篩選可以使用抗體（例如磷酸組蛋白H3抗體）在發(fā)育中胚胎的單細胞水平上跟蹤蛋白質表達，或者固定組織上使用原位雜交跟蹤單個細胞中的基因表達。此外，還可以利用斑馬魚從干細胞群中再生組織的顯著能力，包括毛細胞、色素細胞、骨骼和脊髓的再生。也可以在藥物篩選中使用活胚胎中的熒光報告系統(tǒng)檢查單個細胞和組織。例如，使用熒光報告基因篩選胰腺β細胞的調節(jié)因子，發(fā)現(xiàn)了一組組組蛋白去乙�；�酶（HDAC）抑制劑，即使在高血糖的情況下，也可以降低斑馬魚的血糖水平，并且這些抑制劑在小鼠和人類β細胞模型中具有保守的功能。

斑馬魚模型與人類疾病

斑馬魚模型為許多人類疾病的基礎研究和藥物研究提供了重要的見解，許多被發(fā)現(xiàn)在斑馬魚體內具有拯救疾病活性的小分子已經進入臨床試驗。

耳毒性

與耳聾相關的先天性Usher綜合征已使用斑馬魚精確建模。斑馬魚側線毛細胞與哺乳動物內耳毛細胞的功能相似，已用于篩選預防氨基糖苷類抗生素的耳毒性藥物。ORC－13661是通過斑馬魚模型篩選出的先導藥物，ORC－13661通過高親和力阻斷外毛細胞中的機械電傳導通道，從而保護毛細胞免受氨基糖苷類藥物和順鉑誘導的耳毒性。

ORC－13661的第一階段雙盲安慰劑對照研究于2019年完成，其耐受性良好。與安慰劑組相比，無嚴重的治療相關的不良反應，效力呈現(xiàn)劑量相關性�；�于這些結果，不久將開始一項二期研究，以評估ORC－13661是否可以保護囊性纖維化患者的聽力損失。另一組可能受益于ORC－13661的患者是非結核分枝桿菌感染患者，他們經常使用氨基糖苷類抗生素治療，這可能會導致聽力損失。

干細胞移植

在斑馬魚發(fā)育中的主動脈中尋找造血干細胞誘導物的化學篩選表明，PGE2可以直接刺激造血干細胞的產生和植入。這一原理也在小鼠骨髓移植中得到了證實。

隨后在一期臨床試驗中測試了PGE2，在該試驗中，白血病患者接受兩個臍帶血單位作為干細胞的替代來源，一個用dmPGE2處理，另一個未經處理。兩者都被移植到患者體內，白細胞中的DNA多態(tài)性顯示，12名患者中有10名接受dmPGE2治療的臍血中的中性粒細胞和血小板優(yōu)先植入，接受dmPGE2治療的患者血液植入增強，并且隨后沒有發(fā)生移植物抗宿主病。目前，這種治療方法已成為基因治療試驗中處理造血干細胞的常用方法，它可以改善病毒轉導和干細胞效應。

遺傳性癲癇

Dravet綜合征是一種由SCN1A突變引起的兒童難治性癲癇性腦病。與許多遺傳形式的癲癇一樣，Dravet綜合征沒有明確或令人信服的治療方法。scn1lab功能缺失突變的斑馬魚具有自發(fā)的電圖癲癇發(fā)作和痙攣樣游泳行為，具有兒童Dravet綜合征的臨床特征。此外，與患者一樣，斑馬魚Dravet綜合征模型對抗癲癇藥物具有抗藥性。

通過對3000多種市售和FDA批準的藥物進行篩選，發(fā)現(xiàn)5－HT受體激動劑clemizole是scn1lab突變體中自發(fā)癲癇發(fā)作的化學抑制劑，可抑制痙攣樣行為。EpyGenix Therapeutics目前正在開發(fā)用于臨床的clemizole（EPX－100）和clemizole衍生物（EPX－101、EPX－102和EPX－103）。一期研究證實，EPX－100是安全的，兒童耐受性良好，EPX－100現(xiàn)已進入二期臨床試驗，2020年11月首次給藥。

黑色素瘤

斑馬魚黑色素瘤模型對于理解該疾病的基因組學和病因學以及識別新的治療策略至關重要。斑馬魚黑色素瘤與人類黑色素瘤具有相同的分子和組織病理學特征，表明這些模型與黑色素瘤癌癥生物學和藥物發(fā)現(xiàn)相關。

黑色素瘤起源于黑素細胞譜系，即在發(fā)育過程中從神經嵴出現(xiàn)的色素細胞。通過斑馬魚神經嵴上的小分子篩選，天然化合物咖啡酸苯乙酯（CAPE）被證明是調節(jié)神經嵴的新型調節(jié)劑；此外，抗真菌的clotrimazole被證明在KIT轉基因斑馬魚模型中抑制異位黑色素細胞，并在黑色素瘤細胞中具有活性。

腺樣囊性癌

腺樣囊性癌（ACC）是一種罕見的惡性頭頸癌，起源于唾液腺。復發(fā)或轉移性ACC沒有標準的治療手段，大多數(shù)患者在診斷后2年內死亡。大多數(shù)ACC具有復發(fā)性MYB易位，ACC在分子水平上的特征是主轉錄因子MYB及其控制增殖和分化的靶基因的過度表達。

目前很少有實驗模型可用，培養(yǎng)原代ACC細胞一直是一個挑戰(zhàn)。通過使用斑馬魚細菌人工染色體（BAC）報告系統(tǒng)，能夠高通量篩選myb－GFP表達細胞的調節(jié)因子。通過重復篩選3840個生物活性小分子，發(fā)現(xiàn)全反式維甲酸（ATRA）對myb–GFP表達具有有效和選擇性的抑制作用。目前，一項機構發(fā)起的全反式維甲酸二期研究正在進行中（NCT03999684），盡管完整的試驗結果尚待確定，但在2021美國癌癥研究協(xié)會年會上提交的早期報告表明，某些患者總體耐受性良好，具有一定的穩(wěn)定作用。

未來方向和展望

藥物發(fā)現(xiàn)仍然是一個昂貴而費力的過程，實驗室和臨床環(huán)境之間的巨大科學鴻溝阻礙了藥物開發(fā)�？紤]到斑馬魚和人類之間的共同藥物反應，斑馬魚可能與哺乳動物模型一樣具有強大的臨床前預測效果。

斑馬魚和人類之間共有的生理學特征使斑馬魚成為藥物開發(fā)的重要工具，為新藥物類別打開了大門。斑馬魚正在成為人類癌癥的化身，未來的研究可能進一步涉及其他組織和器官之間的跨物種異種移植，用于藥物研究。為了更好地將新的藥物使用從斑馬魚轉化到人類，需要進一步努力了解斑馬魚體內的藥代動力學。

展望未來的斑馬魚藥物篩選，將多個篩選參數(shù)納入整個動物篩選將有助于我們了解化學靶點和藥物治療的反應，包括遠端靶點和非靶點藥物作用。單細胞組學技術將能夠在大細胞群體中評估藥物的影響，提供疾病的細胞表現(xiàn)以及如何解決疾病的前所未有的細節(jié)。目前，斑馬魚疾病模型和小分子篩選已經展示出令人激動的結果，這也將使斑馬魚為未來的人類疾病治療做出更重大的貢獻。

       原文標題 : 藥物發(fā)現(xiàn)中的斑馬魚疾病模型