從RNA提取到Real Time PCR
01
背景介紹
核糖核酸(縮寫為RNA,即Ribonucleic Acid),存在于生物細(xì)胞(主要分布在細(xì)胞質(zhì)中)以及部分病毒、類病毒中的遺傳信息載體,是以DNA的一條鏈為模板,以堿基互補(bǔ)配對原則,轉(zhuǎn)錄而形成的一條單鏈,主要功能是實現(xiàn)遺傳信息在蛋白質(zhì)上的表達(dá),是遺傳信息向表型轉(zhuǎn)化過程中的橋梁。
02
實驗流程
一、細(xì)胞RNA的提取
研究基因的表達(dá)和調(diào)控時常常要從組織和細(xì)胞中分離和純化RNA。RNA質(zhì)量的高低常常影響cDNA庫,RT-PCR和Northern Blot等分子生物學(xué)實驗的成敗。Trizol是一種總RNA抽提試劑,內(nèi)含異硫氰酸胍等物質(zhì),能迅速破碎細(xì)胞,抑制細(xì)胞釋放出的核酸酶。
實驗所需試劑和材料:Trizol(4℃保存)、無水乙醇、氯仿(三氯甲烷)、DEPC水、異丙醇(-20℃預(yù)冷備用)、移液槍槍頭(RNase-free)、 EP管(RNase-free)。
實驗操作流程:
1.樣品準(zhǔn)備:將細(xì)胞接種于6孔板中,經(jīng)干擾和加藥處理后,吸棄培養(yǎng)基,每孔加1mL處理細(xì)胞用PBS漂洗細(xì)胞兩次。每孔加1 mL TRIzol Regent,4℃;
2.裂解20 min 裂解細(xì)胞。之后用移液器輕輕吹打,使裂解物均勻,并用移液器轉(zhuǎn)移至 RNase-free的1.5 mL離心管中,可放于-80℃保存;
3.超凈臺臺面,實驗所需材料用75%酒精擦拭并紫外照射30min滅菌。通風(fēng)10min后進(jìn)行實驗;
4.冰上完全溶解樣品,向每管裂解物中加入200 μL氯仿,蓋好管蓋,上下輕輕顛倒混勻20s,冰浴 5 min;
5.混合物置于 4℃,12000 r/min離心15 min;吸棄上清,置于超凈臺中室溫放置15 min;
6.離心后,樣品分為三層,上層水相為RNA,中層沉淀為蛋白質(zhì)和DNA,下層為多糖等。小心吸出上層水相400μL(400μL就夠了,建議切勿貪多),轉(zhuǎn)移到新的EP管中;
7.每1 mL裂解物加400 μL預(yù)冷的異丙醇,輕柔顛倒混勻15 s后置于-20℃、1 h沉降RNA;
8.-20℃沉降 1 h 后,沉降體系于4℃,12000 r/min 離心10 min。后打開離心管蓋,將離心管放平,小心傾倒其中液體,保留沉淀;
9.每管1 mL 預(yù)冷的 75%乙醇溶液,蓋好管蓋,用力震蕩離心管懸浮沉淀,漂洗沉淀。后于 4℃ 13000 r/min 離心 10 min,吸棄上清,保留沉淀;
10.吸棄上清的離心管倒置于超凈工作臺中,風(fēng)干10 min;
11.每管加入適量DEPC處理水,溶解RNA沉淀;
12.利用超微量核酸定量儀測定RNA濃度。
注意事項:RNA易分解,實驗在超凈工作臺進(jìn)行是不需要點燃酒精燈,需避火操作。RNase酶是導(dǎo)致RNA降解的最主要的物質(zhì),可以水解RNA的磷酸二酯鍵,廣泛存在于人的皮膚上,因此,在RNA制備有關(guān)的分子學(xué)實驗時,必須戴手套,并且RNA提取實驗中所使用的移液器和EP管需是RNase-free物品。由于DEPC的劇毒性,實驗室是現(xiàn)在一般槍頭與EP管高壓滅菌3次以上。DEPC水現(xiàn)可由市面上的無菌水/RNase-free水代替。
二、運用M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶將RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA
利用Promega 公司生產(chǎn)的M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶將RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。反應(yīng)體系為2 μg RNA,25 μL體系實驗試劑:dNTP(4 ℃保存),M-MLV(-20 ℃保存),RNasin(-20 ℃保存)。
1.超凈臺中取EP管進(jìn)行標(biāo)注,按照圖1,每管加入5 μL的隨機(jī)引物,同時加入2 μg的RNA模板,混勻后置于70℃的恒溫孵育器中5 min,使得隨機(jī)引物與模板鏈孵育結(jié)合,然后迅速置于冰上進(jìn)行冷卻;
2.每管按照5 μL 10 M的dNTP、5 μL的5×Buffer、0.625 μL的RNase inhibitor? 以及1 μL的M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶(酶放置于冰盒中)配制成預(yù)混液,分裝至每個EP管,用DEPC水補(bǔ)齊至終體積25 μL;
3.漩渦震蕩混勻離心之后,置于37℃恒溫孵育器中孵育1 h;
4.調(diào)節(jié)溫度至70℃終止反應(yīng),10min,得到的cDNA至-20℃冰箱中保存?zhèn)溆。逆轉(zhuǎn)錄的過程中需操作迅速、謹(jǐn)防污染;需注意cDNA 不穩(wěn)定,切勿反復(fù)凍融。
三、實時定量PCR
常規(guī)PCR中,擴(kuò)增產(chǎn)物(擴(kuò)增子)是通過終點法來分析檢測,即 PCR 反應(yīng)結(jié)束后,DNA 通過瓊脂糖凝膠電泳,然后進(jìn)行成像分析。而熒光定量 PCR 可以在反應(yīng)進(jìn)行過程中進(jìn)行累積擴(kuò)增產(chǎn)物的分析和檢測,即“實時”。
在反應(yīng)體系中加入熒光分子,通過熒光信號的按比例增加來反應(yīng) DNA 量的增加,使 PCR 產(chǎn)物的實時檢測成為可能。利用熒光信號累積實時監(jiān)測整個PCR進(jìn)程,最后通過標(biāo)準(zhǔn)曲線對未知模板進(jìn)行總量分析或通過Ct值對模板進(jìn)行相對定量。RT-PCR技術(shù)可用于檢測細(xì)胞和組織中基因表達(dá)水平,克隆特定基因 cDNA序列和檢測RNA病毒。
(1)實時定量PCR具體操作:
按照圖中體系在1.5 mL的EP管中配制反應(yīng)預(yù)混物,漩渦震蕩混勻之后,按照預(yù)先安排的順序分裝至八連管中。分裝至八連管之后按照循序加模板,為保證數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確性,樣品每組做3個平行,并根據(jù)引物的數(shù)量設(shè)置陰性對照。預(yù)混應(yīng)體系配制過程中全程避光,配好以后置于掌式離心機(jī)離心數(shù)秒,使所有組分沉降于八連管底部。錫箔紙包住EP板,轉(zhuǎn)移至Real time PCR反應(yīng)儀器中,設(shè)置反應(yīng)程序后,點“Start”啟動反應(yīng)。
(2)連機(jī)依次設(shè)置參數(shù)如下:
a、StepOne Instrument(48 wells):根據(jù)儀器規(guī)格選擇48孔/96孔;
b、Quantitation(相對定量):選擇相對定量的方式,目的基因與內(nèi)參基因Ct數(shù)值;數(shù)值;
c、Comparative(△△Ct):采用△△Ct法對數(shù)據(jù)進(jìn)行處理;
d、SYBR Green:所選試劑中的熒光染料為SYBR Green;
e、cDNA:選用的模板為cDNA,進(jìn)行特異性的擴(kuò)增;
f、輸入待測靶基因的數(shù)目同時輸入相應(yīng)靶基因名稱;
g、輸入待測樣品的數(shù)量、設(shè)置平行性個數(shù)、靶基因的陰性對照及相應(yīng)的待測樣品的名稱;
h、設(shè)置樣品中的control組及陰性對照組;
i、實時PCR的反應(yīng)條件如下表所示。
Stage 1
預(yù)變性
Stage 2
PCR反應(yīng)
Stage 3
溶解曲線
95℃ 2 min
95℃ 10 s
60℃ 30 s
40個循環(huán)
95℃ 1 min
55℃ 1 min
95℃ 15 s
正確的實驗技巧是成功的熒光定量 PCR 反應(yīng)重要然而常被忽視的要素。為得到最佳的實驗結(jié)果,實驗人員要盡可能減少樣品間交叉污染的可能,避免將核酸從一個實驗帶入下一個實驗。以下措施有助于避免實驗污染問題:
? 在樣品準(zhǔn)備和配制反應(yīng)液過程中勤換手套
? 使用清潔的移液槍
? 只使用 PCR 級的水和 PCR 專用試劑進(jìn)行 PCR 實驗
? 用帶旋蓋的 EP 管稀釋和配制反應(yīng)液
四、數(shù)據(jù)分析
1.RT-PCR結(jié)束后,我們可以看到整個擴(kuò)增階段,分為四個階段,對數(shù)據(jù)進(jìn)行一個分析。
2.基線就是擴(kuò)增曲線中的水平部分。
基線:反應(yīng)熒光明顯增加前的背景熒光值。默認(rèn)為3-15Cycles的信號值。
3.閾值:在擴(kuò)增曲線的指數(shù)增長區(qū)域內(nèi)適當(dāng)位置上設(shè)定的熒光檢出界限。
4.CT值是從基線到指數(shù)增長的拐點所對應(yīng)的循環(huán)次數(shù)。
5.Real time PCR 靈敏性強(qiáng),故對樣品質(zhì)量及引物質(zhì)量要求很高。為避免非特異性擴(kuò)增導(dǎo)致實驗結(jié)果Ct值不準(zhǔn)確,建議大家在每次實驗時都要設(shè)置溶解曲線程序。只有溶解曲線為單一峰,才能認(rèn)為實驗數(shù)據(jù)可靠。
具體計算方式為:
先看Ct值,每個基因的三個平行中,舍去差異較大的值,求出平均值。
求組內(nèi)△Ct=組內(nèi)目的基因 Ct – 內(nèi)參 Ct
求組間△△Ct=組間實驗組的△Ct - control組的△Ct
求值:公式(power)=2-△△C
以上便是從細(xì)胞RNA提取到Real Time PCR的全過程,在整個實驗準(zhǔn)備及操作過程都需要仔細(xì)小心、按要求進(jìn)行操作,從而增加實驗的成功率。
原文標(biāo)題 : 從RNA提取到Real Time PCR

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