前言

抗體偶聯(lián)藥物（ADCs）在過去10年中取得了長足的進展，ADC是一種通過一個合理構建的連接子將細胞毒性小分子藥物偶聯(lián)到單克隆抗體上的復合物，可以向腫瘤內選擇性地輸送有效的細胞毒性藥物。

2009 年gemtuzumab ozogamicin （Mylotarg） 是美國食品和藥物管理 局（FDA）批準的第一個 ADC 藥物。目前，FDA 已經批準上市了 11 個 ADC藥物，還有上百個 ADC 藥物正處于臨床研究階段。

ADC對于藥物靶點的選擇，除了首先要在腫瘤過度表達外，這些抗原的另一個重要因素是內吞的效率，這是藥物釋放活性所必需的。事實上，ADC的療效取決于靶向介導的內化在腫瘤細胞內傳遞有效載荷的效率。

ADC內化的途徑和效率，也與ADC藥物的療效和設計息息相關。因為它是連接子選擇可切割、不可切割或pH／還原敏感型的重要因素，以及有效載荷（或其活性代謝物）是否能夠在細胞膜上擴散以提供“旁觀者效應”，還有是否提高了腫瘤殺傷率或有助于劑量限制毒性。因此有必要深入了解ADC的內吞作用和機制，因為它是ADC在體內發(fā)揮藥效中極其重要的第一步。

ADC的相關內吞途徑

一般來說，正常的內吞作用可分為三個階段：（1）芽的形成，（2）膜的彎曲和囊泡的成熟，（3）膜的斷裂并釋放到細胞質中。多種內吞途徑有重疊的方面，因此內吞的一般過程是高度靈活和復雜的。

網格蛋白介導的內吞作用

網格蛋白介導的內吞作用（CME）在概念上是一個簡單的過程，包括幾個連續(xù)和部分重疊的步驟。CME可由質膜上的某些受體結構性啟動，或者需要配體和／或抗體結合后啟動。當細胞質中的內吞衣殼蛋白開始聚集在質膜的內小葉上時，CME就開始了。衣殼蛋白通過從細胞質中招募并與額外的蛋白質適配器相互作用而繼續(xù)組裝和生長。關鍵的銜接蛋白使膜彎曲，從而將內化受體／配體集中到一個“網格蛋白包被坑”（CCP）中。由于CCP內陷增大，CCP頸縮窄時，通過一個斷裂過程與質膜分離。肌動蛋白聚合有助于將CCP向內拉入細胞質，直到斷裂完成，CCP釋放并成為一個網格蛋白包被的囊泡（CCV）。最后，CCV外殼被分解，CCV與內涵體融合以運輸到特定的亞細胞位置，或者可以被回收回細胞表面。

網格蛋白是CME的關鍵成分，由重鏈和輕鏈組成。三個網格蛋白重鏈和輕鏈形成一個三聚體，它與其他三聚體相互作用，并在新興的CCP周圍形成一個多邊形晶格。銜接蛋白2（AP－2）是一種異源四聚體復合物，它介導CCP頸部的收縮。Dynamin是一種GTP酶，在成熟囊泡的頸部形成螺旋狀聚合物。GTP水解后，dynamin誘導囊泡從質膜分裂。

小窩介導的內吞作用

不依賴于網格蛋白的內吞作用包括小窩介導的內吞作用、小窩蛋白非依賴性載體蛋白／GPI－富集的早期內區(qū)室（CLIC／GEEC）和巨胞飲作用。

小窩是質膜的小瓶狀內陷，其特征是高水平的膽固醇和鞘糖脂，通過不依賴于網格蛋白的途徑介導內吞作用，并且存在于大多數細胞類型中。小窩的主要支架蛋白是小窩蛋白，它是形成寡聚體的20–24 kDa完整膜蛋白。小窩蛋白共享共同的支架結構域，這些支架結構域介導與自身和其他包含小窩蛋白結合結構域蛋白質的相互作用。

雖然小窩具有類似CCPs的內陷形態(tài)，但它們是不同的。簡單地說，CCP的密度是恒定的，而小窩的密度會因細胞類型的不同而變化很大。CCPs隨著萌發(fā)的內體成熟而增大，相比之下，小窩囊泡保持不變的大小。一旦進入細胞內，小窩就形成了高階結構，而不是由CCPs形成的簡單的球形內體。

小窩蛋白介導的內吞作用的另一個獨特方面是，只有約1％的小窩是從質膜上萌發(fā)的。在一小部分內化的小窩中，它似乎遵循一條與Rab5（早期內胚體的標志物）共定位的循環(huán)途徑。這可能對以利用小窩蛋白介導內吞作用的受體為靶點的ADC帶來挑戰(zhàn)。

CLIC／GEEC內吞作用

CLIC／GEEC是一種內吞室，主要發(fā)生在配體激活的細胞中，這可能由生長因子、抗體的受體交聯(lián)或細菌毒素和病毒引起。此外，細胞膜必須處于高流動性狀態(tài)，因為CLIC／GEEC在低于生理溫度或膜處于更高張力的情況下不起作用。

CLIC在遷移細胞的前緣增加。識別CLIC／GEEC途徑的其他相關參數包括動力非依賴性質膜斷裂、對膽固醇消耗的敏感性、Rab5／與早期內體融合的獲得、胎盤堿性磷酸酶（PLAP）和與FAK相關的GTPase調節(jié)因子（GRAF1）。

巨胞飲作用

巨胞飲作用是一種更大規(guī)模的內吞作用形式，通常涉及質膜高度皺折的區(qū)域／突起，這些區(qū)域／突起隨后相互融合或與質膜融合。膜皺褶是巨胞飲作用的形態(tài)學特征。

巨胞飲作用依賴于肌動蛋白聚合、Rac1蛋白和p21活化激酶1（PAK1）。PAK1是一個關鍵的調節(jié)因子，因為它與Rac1相互作用，Rac1激活磷脂酰肌醇－3－激酶（PI3K）、Ras、Src和Hsp90，以促進巨胞飲作用。巨胞飲作用也是膽固醇依賴性的，這是招募Rac1所必需的。這些成分最終導致比CME和小窩蛋白更大吸收面積的內吞作用。

ADC靶向抗原的內吞特性

CD33

CD33是一種67kda跨膜糖蛋白受體，通常在正常髓系細胞上表達，由于其在AML細胞上優(yōu)先過表達，是GO的靶點。CD33的胞內免疫受體酪氨酸基抑制基序（ITIM）調節(jié)CD33的內吞作用，可通過CME激活內吞作用。關于內吞效率，AML細胞中CD33的表達水平與其內吞率之間沒有相關性。CD33是一種緩慢內化的抗原，此外，CD33交聯(lián)并不能改善內吞作用。對GO無響應的AML患者可能與CD33受體內吞的功能低下有關。

CD30

CD30是一種120kda跨膜糖蛋白，屬于腫瘤壞死因子受體（TNFR）超家族。其細胞外部分由六個擴展構象的富含半胱氨酸的結構域（CRD）組成。CD30在活化的T細胞和B細胞以及各種淋巴腫瘤（包括霍奇金淋巴瘤和ALCL）上表達。

CD30不具有內吞作用，相反，它因蛋白水解裂解而脫落，CD30的脫落由基質金屬蛋白酶（MMPs）介導。脫落是CD30生物學的一個特征，高濃度的循環(huán)可溶性CD30可以作為監(jiān)測腫瘤進展的血清標志物。對于ADC的療效，升高的CD30循環(huán)水平似乎會隔離注射的ADC，從而減少能夠定位于CD30陽性腫瘤部位的ADC的數量。因此，缺乏內吞作用的結果表明CD30不是理想的ADC靶點。

CD22

CD22是一種140 kDa的跨膜糖蛋白，與CD33一樣，它也是Siglec家族的成員，并與該家族共享多種結構特征。關鍵的區(qū)別在于CD22比CD33大得多，因為它有多個Ig結構域和ITIM／ITIM樣基序。CD22的表達僅限于B細胞，CD22在各種B細胞惡性腫瘤（包括ALL）的大多數母細胞中表達水平升高。

CD22通過CME進行內吞作用。類天然配體通過CD22的結構性快速內吞在細胞內積聚。這些配體在溶酶體中被分類降解，而CD22則循環(huán)回到細胞表面。此外，CD22配體誘導的內吞激活細胞內池，補充或增加細胞表面CD22的表達水平。因此，CD22對ADC具有良好的內吞特性。

CD79b

CD79b僅在未成熟和成熟的B細胞中表達，在惡性腫瘤≥80％的B細胞中過表達。CD79a和CD79b是兩種非共價結合的跨膜蛋白，介導信號傳導和內吞作用。對于后者，CD79a－CD79b異二聚體是控制BCR內吞的支架。BCR內吞作用主要由CME完成，并由AP－2介導。有趣的是，CD79a直接與AP－2的μ亞單位相互作用，進而激活CD79b并導致整個BCR復合物的內吞。

此外，對于ADC來說，CD79a可以作為單體內化，但CD79b卻不能。如果CD79b的近端膜酪氨酸（Y195）發(fā)生突變，AP－2與CD79a的結合就會被阻斷，內吞也被阻斷。在18％的活化B細胞樣DLBCL標本中，Y195發(fā)生突變�？傊�，有證據表明CD79b其內吞活性依賴于整個BCR復合體的內化，而不是作為單體的內化。

TROP－2

Trop2是一種46kDa的單體糖蛋白，具有選擇性過度表達、結構性內吞作用和導向溶酶體等特性，使其成為ADC的一個非常有吸引力的靶點。Trop2的內化機制與CME有關。

觀察到的Trop2強大的內吞作用，一種潛在的解釋可能是由于顯著的Trop2聚集。研究Trop2的構象動力學，發(fā)現Trop2通過位于跨膜結構域的氨基酸“VVVVV”組成的相互作用片段形成天然的同型二聚體。Trop2的二聚作用可以通過其他細胞表面蛋白質進一步將Trop2單體招募到更接近的位置。因此，Trop2簇很可能由多個二聚體通過脂筏和其他膜結合蛋白連接而成。

Trop2與多種配體結合，如claudin－1、claudin－7、cyclin D1和IGF1，然而，這些配體都沒有證明在與Trop2結合或相互作用時被內化。因此，與正常細胞相比，Trop2在腫瘤細胞中發(fā)生的內吞作用更為強烈，這些都表明Trop2是ADC的一個很好的靶點。

BCMA

BCMA或CD269，也稱為TNFR超家族成員17，轉導誘導B細胞存活和增殖的信號。BCMA的分子量僅為20．2 kDa，其配體結合的胞外區(qū)域具有“臂椅”構象，由六個CRD組成。除了多發(fā)性骨髓瘤外，BCMA還表達于許多血液系統(tǒng)惡性腫瘤，如霍奇金淋巴瘤和非霍奇金淋巴瘤。

然而，關于BCMA所利用的精確內吞途徑的知之甚少。與內吞作用有關，唾液酸化是一種調節(jié)功能，它可能誘導BCMA利用CME發(fā)生內吞作用。

HER2

HER2是一種185kda跨膜糖蛋白，屬于EGFR家族。HER2／neu基因的擴增是已知的人類惡性腫瘤和轉移的驅動因素。由于HER2在癌癥中的作用，幾十年來一直被作為治療靶點。HER2也一直是ADCs的靶點，T－DM1和T－DXT都被批準用于HER2陽性轉移性乳腺癌患者。

HER2的內吞存在多種機制，首先是CME，共免疫沉淀清楚的顯示HER2直接與AP－2結合，此外，dynasore能完全阻斷SKBR3細胞的HER2內吞作用；其次小窩蛋白結合基序φxφxxxxφ（φ代表芳香族氨基酸Trp、Phe或Tyr）通常存在于小窩蛋白相關蛋白上，有趣的是，序列WSYGVTIW已在HER2的細胞內激酶結構域中被鑒定出；另外，有研究證明HER2可以利用CLIC／GEEC的內吞途徑。

這些不同的發(fā)現揭示了HER2內吞的重要特征。首先，HER2的內吞作用是混雜的，其次，小窩介導的內吞途徑似乎更常被利用。

Nectin－4

Nectin－4是一種66 kDa 的I型跨膜蛋白，其主要作用是促進細胞間的接觸。Nectin－4作為ADC靶點很有吸引力，因為研究表明，它在幾種腫瘤類型中過表達，但在正常成人組織中幾乎不存在。

目前，沒有發(fā)現天然配體或mAb／ADC與nectin－4的復合物內吞的信息，但是可以借鑒nectin－4結合病原體內吞的研究。Nectin－4也是麻疹病毒的受體，研究表明，麻疹病毒通過巨胞飲作用進入MCF7、HTB－20乳腺癌和DLD－1結直腸癌細胞。病毒進入需要PAK1，相反，dynamin抑制劑Dynasore對病毒進入沒有影響。此外，表達顯性負性小窩蛋白的細胞并不能消除病毒的內吞作用。

基于這些間接研究，nectin－4表現出病毒受體所需的強大的內吞活性。

小結

分析靶受體和ADC的內吞作用內吞可以極大地促進臨床前研究、臨床轉化和患者治療效果。很明顯，內吞作用的效率和ADC靶受體的優(yōu)先過表達狀態(tài)以及其它相關參數（如PK）一樣重要。盡管目前已有11種已批準的ADC，但是由于ADC的技術進步，該領域正在經歷一次爆發(fā)。

藥物劑量－暴露－效應關系的確定是ADC成功的關鍵部分，因此，內吞作用是這種關系的關鍵部分，對于優(yōu)化給藥方案以最大限度地提高治療指數非常重要。然而盡管目前ADC領域如火如荼，但是我們對靶受體的內吞作用仍知之甚少。另外，許多內吞作用的核心成分和關鍵的效應器非常重要，然而這些蛋白可能在癌癥中普遍發(fā)生突變，這也會影響ADC內吞作用和療效。相信隨著該領域的發(fā)展，經過無數次積累的經驗，ADC終會迎來真正的春天。

參考文獻：

1．Impact of EndocytosisMechanisms for the Receptors Targeted by the Currently Approved Antibody－DrugConjugates （ADCs）—A Necessity for Future ADC Research and Development． Pharmaceuticals（Basel）． 2021 Jul； 14（7）： 674．