2021年7月15日，由福建農(nóng)林大學(xué)、中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院（深圳）農(nóng)業(yè)基因組研究所等多家單位共同合作在國(guó)際頂級(jí)期刊Nature Genetics上發(fā)表“Haplotype－resolved genome assembly provides insights into evolutionary history of the tea plant Camellia sinensis”的文章，該研究利用自主開(kāi)發(fā)的新算法破譯了高雜合鐵觀(guān)音的基因組組裝難題，并在此基礎(chǔ)上闡釋了等位特異性表達(dá)應(yīng)對(duì)”遺傳負(fù)荷”的機(jī)制及茶樹(shù)群體進(jìn)化和馴化歷史，為茶樹(shù)育種改良提供了新見(jiàn)解。安諾優(yōu)達(dá)為本次研究提供二代和PacBio三代建庫(kù)測(cè)序服務(wù)。

文章名稱(chēng)：Haplotype－resolved genome assembly provides insights into evolutionary history of the tea plant Camellia sinensis

發(fā)表時(shí)間：2021年7月15日

發(fā)表雜志：Nature Genetics

研究物種：茶樹(shù)（Camellia sinensis）

影響因子：38．330

研究背景

茶葉作為一種全球性的經(jīng)濟(jì)作物，有很強(qiáng)的保健作用。茶樹(shù)是無(wú)性繁殖的，這種方式可以有效地維持因有性重組而分離或丟失的有價(jià)值的基因型。然而，這種繁殖方式也會(huì)積累大量有害突變，導(dǎo)致“穆勒棘輪”效應(yīng)，致使作物遭受損失。茶樹(shù)是二倍體，含有15對(duì)同源染色體，嵌合式的基因組組裝（篩選同源染色體中的一份拷貝作為代表組裝到染色體水平）可能會(huì)錯(cuò)過(guò)重要選擇性狀的等位變異，而分型組裝（不同親本的兩套同源染色體同時(shí)組裝到染色體水平）能更完整地呈現(xiàn)二倍體基因組的全部遺傳信息。本文通過(guò)對(duì)中國(guó)烏龍茶品種鐵觀(guān)音及幾個(gè)主要的茶樹(shù)品種和近緣物種進(jìn)行測(cè)序及單體型組裝，探索地理上不同的茶樹(shù)群體之間的遺傳多樣性，為深入了解茶樹(shù)的馴化史和進(jìn)化史提供依據(jù)。

樣本選擇

山茶植株芽、根、莖、花、幼葉和成熟葉

測(cè)序策略

DNA：

PacBio Sequel II平臺(tái)基因組測(cè)序 114X

Illumina NovaSeq 150 bp雙端測(cè)序，DNA小片段文庫(kù)

Illumina NovaSeq，Hi－C文庫(kù) 99．4X

RNA：

PacBio Sequel II平臺(tái)，Iso－Seq文庫(kù)

研究思路

研究結(jié)果

1．基因組組裝與注釋

鐵觀(guān)音的基因組大小約為3．15 Gb，雜合度為2．31％。利用PacBio長(zhǎng)讀長(zhǎng)對(duì)原始數(shù)據(jù)進(jìn)行組裝得到初始contig，大小為5．41 Gb。將Khaper算法過(guò)濾產(chǎn)生的單倍體組裝結(jié)果掛載到15個(gè)染色體（圖1），得到單倍體參考基因組（monoploid reference genome），大小為3．03 Gb。同時(shí)利用ALLHiC算法得到鐵觀(guān)音單體型基因組（haplotype－resolved genome），大小為5．98 Gb。共線(xiàn)性分析顯示它們的基因順序高度一致。

圖1鐵觀(guān)音基因組組裝和質(zhì)量評(píng)估

（a）單倍體參考基因組circos圖，呈現(xiàn)15條染色體特征；（b）Hi－C熱圖呈現(xiàn)15條染色體組裝質(zhì)量；（c）LAI（LTR Assembly Index）評(píng)估鐵觀(guān)音基因組和已發(fā)表茶樹(shù)基因組組裝質(zhì)量；（d）鐵觀(guān)音單倍體參考基因組和單體型基因組的共線(xiàn)性比較

2．等位基因特異性表達(dá)

利用鐵觀(guān)音不同組織的全基因組測(cè)序，分離得到14，691個(gè)等位基因（圖2），其中1，528個(gè)基因存在一致性的等位特異性表達(dá)（consistent allele－specific expression，  ASEGs），即一個(gè)等位基因在所有組織和樣本中的表達(dá)都高于另一等位基因�；�因富集分析顯示這些基因參與核糖體等多個(gè)生物學(xué)基本過(guò)程，與克服有害突變的潛在機(jī)制相關(guān)。同時(shí)還發(fā)現(xiàn)了386個(gè)非一致的ASEGs，它們?cè)诓煌�組織的等位基因之間存在特異性表達(dá)。其中幾個(gè)基因與揮發(fā)性有機(jī)化合物的生物合成有關(guān)，包括黃酮和黃酮醇等的生物合成途徑，這與植物的適應(yīng)性演化相關(guān)。結(jié)果表明，在鐵觀(guān)音基因組中，一致性的ASEG明顯多于不一致的ASEG（1，528 vs 386），這一趨勢(shì)與雜交水稻的結(jié)果正好相反，即在雜交水稻中，不一致的ASEG遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于一致性的ASEG。這種現(xiàn)象或許可以用雜種優(yōu)勢(shì)理論中的顯性效應(yīng)解釋?zhuān)�長(zhǎng)期無(wú)性繁殖的茶樹(shù)利用優(yōu)勢(shì)等位基因應(yīng)答不斷積累的遺傳負(fù)荷，以保持個(gè)體的適應(yīng)度。

圖2 茶樹(shù)單倍型基因組等位不平衡

（a） 兩個(gè)單倍型序列的比對(duì)（10 Mb非重疊的窗口）；（b）等位基因CDS序列比較；（c）等位基因的選擇壓力分析；（d）等位基因的非同義替換位點(diǎn)數(shù)目分布；（e）等位特異性表達(dá)基因（ASEGs）在茶樹(shù)葉片中的表達(dá)情況；（f）舉例說(shuō)明一致性的ASEGs（CsSRC2）；（g）舉例說(shuō)明非一致的ASEGs（CsGGPS1）

3．茶樹(shù)遺傳變異和群體結(jié)構(gòu)分析

通過(guò)對(duì)161份茶樹(shù)種質(zhì)資源重測(cè)序數(shù)據(jù)分析，發(fā)現(xiàn)樣本主要分為三類(lèi)（圖3），分別為大理茶，大葉茶和小葉茶，與茶樹(shù)的形態(tài)學(xué)分類(lèi)一致。另外大葉茶可以分類(lèi)古大葉茶和栽培大葉茶；而小葉茶依據(jù)地理分布可分為四個(gè)亞組，分別為SSJ（陜西，四川，江西），ZJNFJ（浙江和福建北部），SFJ（福建南部），HHA（湖北，湖南和安徽）。TreeMix分析發(fā)現(xiàn)這些茶樹(shù)之間存在顯著的基因流動(dòng)，表明種內(nèi)基因交流頻繁，其中一些與有記錄的茶樹(shù)雜交育種歷史相吻合。

圖3茶樹(shù)群體系統(tǒng)進(jìn)化與群體結(jié)構(gòu)分析

（a）重測(cè)序樣本的地理分布；（b）群體系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)；（c）PCA主成分分析；（d）群體遺傳結(jié)構(gòu)分析（k＝7）

4．大葉茶和小葉茶的進(jìn)化史和馴化史

對(duì)14種山茶屬植物的21株單株進(jìn)行了全基因組測(cè)序，通過(guò)群體遺傳分析發(fā)現(xiàn)大葉茶和小葉茶具有不同的進(jìn)化史。在Gelasian epoch時(shí)期（259－181萬(wàn)年前），劇烈的氣候變化很可能導(dǎo)致了整個(gè)茶樹(shù)物種（包括大葉茶和小葉茶）的群體收縮；兩個(gè)變種分化后，僅小葉茶在Last Glacial Maximum時(shí)期（2．65－1．9萬(wàn)年前）可能由于溫度驟降出現(xiàn)了再一次的群體收縮，但隨后適應(yīng)了環(huán)境的小葉茶迅速擴(kuò)張，群體規(guī)模得到恢復(fù)。該分析表明，大葉茶和小葉茶分化后的進(jìn)化史不同（圖4）。通過(guò)對(duì)大葉茶和小葉茶馴化基因的分析，發(fā)現(xiàn)它們的馴化過(guò)程是并行的（即獨(dú)立馴化），這些馴化基因參與了一系列重要的生物學(xué)過(guò)程且受人工選育的偏好性影響。基于KEGG分析，在大葉茶馴化早期以參與氧化石墨烯苷轉(zhuǎn)運(yùn)、糖苷轉(zhuǎn)運(yùn)通路為主，后期品種改良主要集中在合成生物堿和芳香化合物等。例如，研究人員鑒定到CsXDH基因在大葉茶品種改良階段受到強(qiáng)烈的人工選擇，該基因編碼黃嘌呤脫氫酶，是咖啡因合成通路的重要基因。而小葉茶品種的早期馴化與植物抵御相關(guān)，改良過(guò)程主要集中在花發(fā)育的調(diào)控和對(duì)一氧化氮的響應(yīng)，已有研究表明，NO的積累可以加速γ－氨基丁酸的消耗從而幫助植物抵御冷脅迫，這表明篩選耐寒的品種也是人工選育的重要目標(biāo)。

圖4大葉茶和小葉茶的平行馴化

（a）平行馴化模式圖；（b）全基因組的選擇性清除信號(hào)；（c－f）重要基因的人工選擇信號(hào)（XDH，CM，F(xiàn)3’H，BAS1，DWF4）；（g）人工選擇基因的表達(dá)情況

小結(jié)

本研究成功組裝了兩套鐵觀(guān)音基因組（單倍體參考基因組和單體型基因組）。通過(guò)對(duì)等位基因特異性表達(dá)的分析，預(yù)測(cè)顯性效應(yīng)可能是鐵觀(guān)音應(yīng)對(duì)遺傳負(fù)荷的重要機(jī)制。通過(guò)對(duì)茶樹(shù)種群水平的遺傳分析，揭示了該物種的進(jìn)化和人工馴化歷史。該成果為利用組學(xué)分析和分子生物學(xué)技術(shù)挖掘功能基因、解析其背后的遺傳調(diào)控機(jī)制，開(kāi)展基于大數(shù)據(jù)驅(qū)動(dòng)的基因組智能設(shè)計(jì)育種奠定了堅(jiān)實(shí)的理論基礎(chǔ)，同時(shí)也為縮短育種周期、提高育種效率、降低育種成本提供了科學(xué)依據(jù)。

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參考文獻(xiàn)：

Zhang X， Chen S， Shi L， et al． Haplotype－resolved genome assembly provides insights into evolutionary history of the tea plant Camellia sinensis ［published online ahead of print， 2021 Jul 15］．Nat Genet． 2021；10．1038／s41588－021－00895－y．