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題目：植入前胚胎發(fā)育的可變剪切特點(diǎn)

一、研究背景

植入前胚胎發(fā)育在胎兒發(fā)育中起著至關(guān)重要的作用，需要精確的時(shí)空控制基因表達(dá)，所以對(duì)于胚胎發(fā)育中基因表達(dá)的分析顯得至關(guān)重要。隨著近年來(lái)RNA測(cè)序技術(shù)的發(fā)展（特別是單細(xì)胞RNA測(cè)序），有關(guān)植入前胚胎發(fā)育的研究也不斷取得突破。

可變剪切（AS）即一條未經(jīng)剪接的RNA，含有的多種外顯子被剪成的不同組合，可翻譯出不同的蛋白質(zhì)。已有的研究表明，可變剪切對(duì)細(xì)胞的生長(zhǎng)發(fā)育起著關(guān)鍵作用。

二、分析思路

三、結(jié)果解讀兩細(xì)胞階段是植入前胚胎發(fā)育中基因轉(zhuǎn)錄的關(guān)鍵階段

正如研究背景中說(shuō)到的，可變剪切在基因的表達(dá)過(guò)程中起著關(guān)鍵作用。首先探究了胚胎發(fā)育過(guò)程中轉(zhuǎn)錄的關(guān)鍵階段，通過(guò)利用RNA－seq數(shù)據(jù)、STAR軟件，獲取了不同階段表達(dá)的基因數(shù)目；同時(shí)，根據(jù)基因表達(dá)（FPKM），確定了植入前胚胎發(fā)育中差異表達(dá)的基因（圖一）從圖一的結(jié)果可以看到，兩細(xì)胞階段基因表達(dá)量最高，這提示兩細(xì)胞階段可能是轉(zhuǎn)錄的關(guān)鍵階段。

圖1：不同階段基因的表達(dá)數(shù)目

為了鑒定在兩細(xì)胞階段特異性表達(dá)的基因，使用了模糊c－均值（FCM）方法對(duì)植入前胚胎發(fā)育的RNA－seq數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。將表達(dá)的基因分為8類，其中在第2類中鑒別出了1415個(gè)基因（這代表這些基因在兩細(xì)胞階段特異性表達(dá)，見(jiàn)圖2）并對(duì)這些鑒別出的基因進(jìn)行GO分析（分析結(jié)果見(jiàn)圖3左圖）

既往報(bào)道顯示兩細(xì)胞階段是染色質(zhì)開(kāi)始構(gòu)建拓?fù)潢P(guān)聯(lián)域（TAD）的時(shí)刻，在第2類中發(fā)現(xiàn)了CTCF（CTCF被認(rèn)為與拓?fù)潢P(guān)聯(lián)域的構(gòu)建有關(guān)），為下一步作了鋪墊。（圖3右圖）

圖2：基因表達(dá)的聚類

圖3：GO分析以及CTCF的表達(dá)情況

植入前胚胎發(fā)育過(guò)程中可變剪接的動(dòng)態(tài)變化

在得到關(guān)鍵階段后，開(kāi)始研究文章的主要話題：可變剪切。發(fā)現(xiàn)兩細(xì)胞階段和合子階段的基因表達(dá)情況與RNA剪切密切相關(guān)（圖4）

圖4

為了說(shuō)明剪切在胚胎發(fā)育過(guò)程中的具體作用，使用拼接百分比（PSI）來(lái)測(cè)量與剪接點(diǎn)對(duì)齊的讀取比例，根據(jù)PSI將基因分為了損失和增益兩組。熱圖（圖5）顯示了PSI在植入前胚胎發(fā)育中動(dòng)態(tài)變化，表明可變剪切在植入前胚胎發(fā)育中廣泛存在。此外，還發(fā)現(xiàn)兩細(xì)胞階段的可變剪切數(shù)目最多。

圖5：不同階段PSI的情況

兩細(xì)胞階段的可變剪切

在說(shuō)明兩細(xì)胞階段是關(guān)鍵階段且可變剪切在該階段數(shù)目最多之后，開(kāi)始進(jìn)一步研究該階段可變剪切的具體情況。使用Venn圖鑒定了695個(gè)在兩細(xì)胞階段發(fā)生AS的基因，并利用STRING得到了PPI網(wǎng)絡(luò)，該網(wǎng)絡(luò)可分為9個(gè)模塊。

圖6：Venn圖和PPI網(wǎng)絡(luò)

在這些基因中，重點(diǎn)關(guān)注了 Smarcb1，因?yàn)樵摶�因被�?bào)道與染色質(zhì)重塑有關(guān)。外顯子計(jì)數(shù)表明大多數(shù)AS發(fā)生在7－9、13－27和23－27外顯子上，后者對(duì)應(yīng)于SMARCB1 CDS的3＇端；而該基因的C末端結(jié)構(gòu)域（CTD）中存在突變會(huì)導(dǎo)致人類細(xì)胞中主要基因調(diào)控和形態(tài)的改變，這反過(guò)來(lái)提示這些不同的亞型可能在染色質(zhì)重塑的調(diào)節(jié)中起作用。（外顯子計(jì)數(shù)結(jié)果見(jiàn)圖7）此外，GO分析顯示這些基因與DNA ／ RNA過(guò)程和細(xì)胞周期高度相關(guān)，提示他們可能與接下來(lái)的增殖分化有關(guān)。

圖7：外顯子計(jì)數(shù)和GO分析結(jié)果

植入前胚胎發(fā)育中可變剪切類型的差異

利用rMATs（一款對(duì)RNA－Seq數(shù)據(jù)進(jìn)行差異可變剪切分析的軟件），檢測(cè)每個(gè)階段可變剪切的類型，分為5類：跳過(guò)外顯子（SE），替代5＇剪接位點(diǎn)（A5SS），替代3＇剪接位點(diǎn)（A3SS），互斥外顯子（MXE）和保留內(nèi)含子（RI），并發(fā)現(xiàn)SE和MXE類型在AS中占很大比例且這兩種類型在兩細(xì)胞階段十分豐富（這也與前面所說(shuō)的“兩細(xì)胞階段是可變剪切的重要階段”印證）

圖8：不同階段可變剪切的類型

此外，AS基因在兩細(xì)胞階段和其他階段的表達(dá)明顯不同（圖4c），也支持了之前的發(fā)現(xiàn)（圖9）

圖9：AS相關(guān)基因在不同階段的表達(dá)

兩細(xì)胞階段可變剪切與TAD有關(guān)

據(jù)報(bào)道，TAD在兩細(xì)胞階段開(kāi)始形成，染色質(zhì)開(kāi)始重塑。為了研究染色質(zhì)組織的動(dòng)態(tài)變化是否與AS相關(guān)，分析了Hi－C兩細(xì)胞階段的數(shù)據(jù)，在3628個(gè)基因中發(fā)現(xiàn)了691個(gè)位于TAD的AS相關(guān)基因，結(jié)果表明，TAD中發(fā)生了大量AS。以Smc4為例（圖10左），其中藍(lán)色代表A compartment，橙色代表B compartment；下面則是Smc4在合子期和兩細(xì)胞階段的表達(dá)情況。

為了確認(rèn)AS在TAD中特異性富集，計(jì)算了絕緣分?jǐn)?shù)（IS），更高的IS表明AS在TAD中特異性富集。然后在全基因組范圍內(nèi)分析了AS的發(fā)生頻率，circos plot顯示，AS在TAD中富集，但與A ／ B compartment無(wú)關(guān)（從外到內(nèi)的圓圈依次代表A ／ B compartment，密度，TAD邊界和IS得分）。

圖10：Smc4（左）circos plot展示AS在全基因組的發(fā)生頻率（右）

小結(jié)

首先證明，在植入前胚胎發(fā)育的階段中，兩細(xì)胞階段具有更高數(shù)量的表達(dá)基因。在此基礎(chǔ)上，確定了在兩細(xì)胞階段高表達(dá)的基因簇，并在該階段檢測(cè)可變剪切的類型，發(fā)現(xiàn)可變剪切在兩細(xì)胞階段發(fā)生頻率較高。最后，發(fā)現(xiàn)AS與染色質(zhì)結(jié)構(gòu)有關(guān)且在TAD中尤為常見(jiàn)。所以，植入前胚胎發(fā)育的轉(zhuǎn)錄過(guò)程大致為：一些與染色質(zhì)結(jié)構(gòu)相關(guān)的基因的轉(zhuǎn)錄被啟動(dòng)，以促進(jìn)兩細(xì)胞期TAD的形成，然后這些TAD進(jìn)一步促進(jìn)其他細(xì)胞發(fā)育相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄－－構(gòu)成一個(gè)自我調(diào)節(jié)的環(huán)路。