HNF4調(diào)節(jié)脂肪酸氧化,是小鼠腸道干細(xì)胞更新所必需的
文章背景簡(jiǎn)介
腸上皮細(xì)胞具有自我更新和產(chǎn)生分化細(xì)胞的能力,每3-5天發(fā)生一次更替,這種更替是被活躍的循環(huán)干細(xì)胞群(其特征是具有Lgr5表達(dá))所推動(dòng)的。腸道干細(xì)胞(又稱為L(zhǎng)gr5+隱窩基底柱狀細(xì)胞或ISCs)及其增殖后代被嵌套在稱為隱窩的杯狀結(jié)構(gòu)中,而管腔投射狀的絨毛完全由分化細(xì)胞組成。
營(yíng)養(yǎng)調(diào)節(jié)和代謝控制在干細(xì)胞生物學(xué)中具有重要的作用。研究表明,腸道干細(xì)胞(ISCs)對(duì)熱量限制和包括脂肪酸、葡萄糖、N-乙酰-D-葡萄糖胺和氨基酸在內(nèi)的膳食營(yíng)養(yǎng)素有反應(yīng)。此前研究表明,LGR5+細(xì)胞特別依賴于線粒體代謝。在ISCs中,脂肪酸氧化能夠刺激氧化磷酸化。這些研究表明,細(xì)胞代謝是腸道干細(xì)胞穩(wěn)態(tài)的基礎(chǔ)調(diào)節(jié)因子。然而,目前尚不清楚腸道干細(xì)胞獨(dú)特的代謝狀態(tài)是如何建立的。
由于脂肪酸β-氧化(FAO)是多種組織中干細(xì)胞維持的關(guān)鍵,因此了解ISCs通過FAO實(shí)現(xiàn)自我更新的調(diào)節(jié)機(jī)制是有必要的。肝細(xì)胞核因子4(HNF4)有一個(gè)保守的配體結(jié)合區(qū),能夠與脂肪酸組成性結(jié)合在一起。HNF4A是代謝穩(wěn)態(tài)的重要調(diào)節(jié)因子,參與肝臟脂質(zhì)代謝基因的轉(zhuǎn)錄。與;瑿oA代謝相關(guān)的基因被確定為是HNF4A的靶點(diǎn),HNF4A能夠結(jié)合;瑿oA結(jié)合蛋白和脂酰-CoA硫酯。
腸道干細(xì)胞與腸道疾病和癌癥相關(guān)。了解腸道干細(xì)胞(ISC)生理調(diào)控機(jī)制對(duì)人類健康和再生醫(yī)學(xué)具有重要意義。然而,調(diào)控ISC代謝的機(jī)制尚不清楚。基于FAO在干細(xì)胞維持中的潛在作用以及HNF4在調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝過程中的重要性,美國(guó)羅格斯大學(xué)新澤西人類遺傳學(xué)研究所、美國(guó)新不倫瑞克新澤西州羅格斯癌癥研究所的Lei Chen, Roshan P. Vasoya, Natalie H. Toke等人研究了HNF4轉(zhuǎn)錄因子是如何影響ISC代謝,以及HNF4依賴性的代謝調(diào)節(jié)是否是維持ISC所必需的。該研究于2019年以“HNF4 Regulates Fatty Acid Oxidation and is Required for Renewal of Intestinal Stem Cells in Mice”為題發(fā)表在《Gastroenterology》雜志上(IF2018=19.233,醫(yī)學(xué)1區(qū))。
所用到的主要方法
1.腸上皮、絨毛和隱窩細(xì)胞分離
2.組織學(xué)和免疫染色
3. qRT-PCR
4. Western blot
5.類器官培養(yǎng)、計(jì)數(shù)、免疫熒光
6.FAO活性檢測(cè)
7.LC-MS分析
文章主要內(nèi)容摘要
腸道干細(xì)胞(ISCs)的功能受飲食和代謝途徑的調(diào)節(jié)。肝細(xì)胞核因子4(HNF4)是結(jié)合脂肪酸的轉(zhuǎn)錄因子。作者選用Villin-CreERT2、Lgr5-EGFP-IRES-CreERT2、Hnf4af/f和Hnf4gCrispr/Crispr小鼠研究了HNF4轉(zhuǎn)錄因子的代謝調(diào)節(jié)機(jī)制及在小鼠ISCs中的功能。作者從腸道分離隱窩和絨毛細(xì)胞,用帶熒光標(biāo)記的脂肪酸或葡萄糖類似物孵育,然后通過共聚焦顯微鏡觀察。檢測(cè)Hnf4agDKO和對(duì)照小鼠近端小腸收集的細(xì)胞中脂肪酸氧化活性和三羧酸循環(huán)(TCA)代謝產(chǎn)物。此外,作者進(jìn)行了染色質(zhì)免疫沉淀和基因表達(dá)譜分析,以確定受HNF4因子調(diào)控的基因;從十二指腸隱窩提取類器官,用標(biāo)記的棕櫚酸酯或乙酸酯孵育,檢測(cè)TCA代謝產(chǎn)物或脂肪酸的產(chǎn)生;還通過乙酸或二氯乙酸進(jìn)行了代謝干預(yù)。
研究結(jié)果表明,隱窩細(xì)胞能夠迅速吸收帶標(biāo)記的脂肪酸,在用FAO(脂肪酸β氧化)抑制劑Etomoxir孵育的類器官中,LGR5+干細(xì)胞標(biāo)志物(Lgr5、Olfm4、Smoc2、Msi1和Ascl2)的mRNA水平被下調(diào),表明FAO是ISCs更新所必需的。HNF4A和HNF4G在ISCs和整個(gè)腸上皮中均有表達(dá)。HNF4A和HNF4G的單基因敲除不影響ISCs的維持,但雙基因敲除會(huì)導(dǎo)致ISC丟失,致使干細(xì)胞不能再生。FAO支持ISC更新,HNF4轉(zhuǎn)錄因子直接激活A(yù)csl5和Acsf2(編碼長(zhǎng)鏈脂酰CoA合成酶)、Slc27a2(編碼脂肪酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白)、Fabp2(編碼脂肪酸結(jié)合蛋白2)和Hadh(編碼羥基-CoA脫氫酶)等FAO基因。與對(duì)照小鼠相比,Hnf4agDKO小鼠腸上皮FAO基因表達(dá)水平、FAO活性和TCA代謝產(chǎn)物均顯著降低,但脂肪酸合成轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物增加。從雙基因敲除小鼠腸道分離的隱窩與乙酸或二氯乙酸共培養(yǎng)能夠恢復(fù)腸道干細(xì)胞。綜合而言,在小鼠中,轉(zhuǎn)錄因子HNF4A和HNF4G會(huì)調(diào)節(jié)脂肪酸氧化所需基因的表達(dá),這是腸干細(xì)胞更新所必需的。

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