文章背景簡(jiǎn)介

腸上皮細(xì)胞具有自我更新和產(chǎn)生分化細(xì)胞的能力，每3－5天發(fā)生一次更替，這種更替是被活躍的循環(huán)干細(xì)胞群（其特征是具有Lgr5表達(dá)）所推動(dòng)的。腸道干細(xì)胞（又稱為L(zhǎng)gr5＋隱窩基底柱狀細(xì)胞或ISCs）及其增殖后代被嵌套在稱為隱窩的杯狀結(jié)構(gòu)中，而管腔投射狀的絨毛完全由分化細(xì)胞組成。

營(yíng)養(yǎng)調(diào)節(jié)和代謝控制在干細(xì)胞生物學(xué)中具有重要的作用。研究表明，腸道干細(xì)胞（ISCs）對(duì)熱量限制和包括脂肪酸、葡萄糖、N－乙酰－D－葡萄糖胺和氨基酸在內(nèi)的膳食營(yíng)養(yǎng)素有反應(yīng)。此前研究表明，LGR5＋細(xì)胞特別依賴于線粒體代謝。在ISCs中，脂肪酸氧化能夠刺激氧化磷酸化。這些研究表明，細(xì)胞代謝是腸道干細(xì)胞穩(wěn)態(tài)的基礎(chǔ)調(diào)節(jié)因子。然而，目前尚不清楚腸道干細(xì)胞獨(dú)特的代謝狀態(tài)是如何建立的。

由于脂肪酸β－氧化（FAO）是多種組織中干細(xì)胞維持的關(guān)鍵，因此了解ISCs通過FAO實(shí)現(xiàn)自我更新的調(diào)節(jié)機(jī)制是有必要的。肝細(xì)胞核因子4（HNF4）有一個(gè)保守的配體結(jié)合區(qū)，能夠與脂肪酸組成性結(jié)合在一起。HNF4A是代謝穩(wěn)態(tài)的重要調(diào)節(jié)因子，參與肝臟脂質(zhì)代謝基因的轉(zhuǎn)錄。與�；�－CoA代謝相關(guān)的基因被確定為是HNF4A的靶點(diǎn)，HNF4A能夠結(jié)合�；�－CoA結(jié)合蛋白和脂酰－CoA硫酯。

腸道干細(xì)胞與腸道疾病和癌癥相關(guān)。了解腸道干細(xì)胞（ISC）生理調(diào)控機(jī)制對(duì)人類健康和再生醫(yī)學(xué)具有重要意義。然而，調(diào)控ISC代謝的機(jī)制尚不清楚。基于FAO在干細(xì)胞維持中的潛在作用以及HNF4在調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝過程中的重要性，美國(guó)羅格斯大學(xué)新澤西人類遺傳學(xué)研究所、美國(guó)新不倫瑞克新澤西州羅格斯癌癥研究所的Lei Chen， Roshan P． Vasoya， Natalie H． Toke等人研究了HNF4轉(zhuǎn)錄因子是如何影響ISC代謝，以及HNF4依賴性的代謝調(diào)節(jié)是否是維持ISC所必需的。該研究于2019年以“HNF4 Regulates Fatty Acid Oxidation and is Required for Renewal of Intestinal Stem Cells in Mice”為題發(fā)表在《Gastroenterology》雜志上（IF2018＝19．233，醫(yī)學(xué)1區(qū)）。

所用到的主要方法

1．腸上皮、絨毛和隱窩細(xì)胞分離

2．組織學(xué)和免疫染色

3． qRT－PCR

4． Western blot

5．類器官培養(yǎng)、計(jì)數(shù)、免疫熒光

6．FAO活性檢測(cè)

7．LC－MS分析

文章主要內(nèi)容摘要

腸道干細(xì)胞（ISCs）的功能受飲食和代謝途徑的調(diào)節(jié)。肝細(xì)胞核因子4（HNF4）是結(jié)合脂肪酸的轉(zhuǎn)錄因子。作者選用Villin－CreERT2、Lgr5－EGFP－IRES－CreERT2、Hnf4af／f和Hnf4gCrispr／Crispr小鼠研究了HNF4轉(zhuǎn)錄因子的代謝調(diào)節(jié)機(jī)制及在小鼠ISCs中的功能。作者從腸道分離隱窩和絨毛細(xì)胞，用帶熒光標(biāo)記的脂肪酸或葡萄糖類似物孵育，然后通過共聚焦顯微鏡觀察。檢測(cè)Hnf4agDKO和對(duì)照小鼠近端小腸收集的細(xì)胞中脂肪酸氧化活性和三羧酸循環(huán)（TCA）代謝產(chǎn)物。此外，作者進(jìn)行了染色質(zhì)免疫沉淀和基因表達(dá)譜分析，以確定受HNF4因子調(diào)控的基因；從十二指腸隱窩提取類器官，用標(biāo)記的棕櫚酸酯或乙酸酯孵育，檢測(cè)TCA代謝產(chǎn)物或脂肪酸的產(chǎn)生；還通過乙酸或二氯乙酸進(jìn)行了代謝干預(yù)。

研究結(jié)果表明，隱窩細(xì)胞能夠迅速吸收帶標(biāo)記的脂肪酸，在用FAO（脂肪酸β氧化）抑制劑Etomoxir孵育的類器官中，LGR5＋干細(xì)胞標(biāo)志物（Lgr5、Olfm4、Smoc2、Msi1和Ascl2）的mRNA水平被下調(diào)，表明FAO是ISCs更新所必需的。HNF4A和HNF4G在ISCs和整個(gè)腸上皮中均有表達(dá)。HNF4A和HNF4G的單基因敲除不影響ISCs的維持，但雙基因敲除會(huì)導(dǎo)致ISC丟失，致使干細(xì)胞不能再生。FAO支持ISC更新，HNF4轉(zhuǎn)錄因子直接激活A(yù)csl5和Acsf2（編碼長(zhǎng)鏈脂酰CoA合成酶）、Slc27a2（編碼脂肪酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白）、Fabp2（編碼脂肪酸結(jié)合蛋白2）和Hadh（編碼羥基－CoA脫氫酶）等FAO基因。與對(duì)照小鼠相比，Hnf4agDKO小鼠腸上皮FAO基因表達(dá)水平、FAO活性和TCA代謝產(chǎn)物均顯著降低，但脂肪酸合成轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物增加。從雙基因敲除小鼠腸道分離的隱窩與乙酸或二氯乙酸共培養(yǎng)能夠恢復(fù)腸道干細(xì)胞。綜合而言，在小鼠中，轉(zhuǎn)錄因子HNF4A和HNF4G會(huì)調(diào)節(jié)脂肪酸氧化所需基因的表達(dá)，這是腸干細(xì)胞更新所必需的。