前言

免疫檢查點(diǎn)抑制劑的出現(xiàn)在腫瘤免疫治療領(lǐng)域取得了巨大的成功，但大多數(shù)患者仍然未能獲得理想的臨床反應(yīng)。人們提出了許多關(guān)于免疫治療抵抗的解釋，包括低抑制性受體（IR）配體表達(dá)，新表位的低免疫原性，高腫瘤負(fù)荷與炎癥反應(yīng)比以及免疫排斥等。

檢查點(diǎn)阻斷療法的廣泛作用機(jī)制是通過(guò)IRs逆轉(zhuǎn)固有的T細(xì)胞抑制。這些藥物干擾了腫瘤微環(huán)境（TME）中CD8＋T細(xì)胞表達(dá)的IRs與相應(yīng)配體的結(jié)合，從而促進(jìn)了效應(yīng)T細(xì)胞細(xì)胞因子的產(chǎn)生和T細(xì)胞對(duì)刺激的反應(yīng)增殖。另一方面，IR阻斷對(duì)TME中免疫抑制細(xì)胞（尤其是Treg細(xì)胞）功能的細(xì)胞內(nèi)在影響值得進(jìn)一步研究。盡管CTLA－4、TIGIT、和TIM標(biāo)記了更多抑制性的Treg細(xì)胞，但PD1和LAG3的作用是模棱兩可的，并且可能與具體情況有關(guān)。最近的一篇論文表明，抗PD1治療可使治療中進(jìn)展過(guò)度的患者體內(nèi)的PD1＋Treg細(xì)胞恢復(fù)活力。因此，對(duì)于該領(lǐng)域來(lái)說(shuō)，檢查點(diǎn)阻斷如何協(xié)調(diào)促進(jìn)CD8＋T細(xì)胞激活和加強(qiáng)Treg細(xì)胞抑制之間的平衡是至關(guān)重要的。

近年來(lái)，神經(jīng)纖毛蛋白－1（neuronilin－1，NRP1）因其強(qiáng)大的雙重功能：增強(qiáng)Treg細(xì)胞抑制和限制CD8＋T細(xì)胞的持久反應(yīng)，在免疫腫瘤學(xué)領(lǐng)域引起了廣泛的關(guān)注。盡管最初被認(rèn)為是一種Treg細(xì)胞標(biāo)志物，新的研究表明NRP1不僅對(duì)TME中固有的Treg細(xì)胞穩(wěn)定性是必需的，而且它還顯著地抑制CD8＋T細(xì)胞的抗腫瘤功能。另外，它在髓系細(xì)胞亞群中也高度表達(dá)，但其在這方面的功能不太明確。已有的臨床前結(jié)果進(jìn)一步證明NRP1拮抗作用與已建立的免疫療法相結(jié)合的可行性。NRP1在TME中作為一個(gè)關(guān)鍵的免疫調(diào)節(jié)劑具有誘人的開(kāi)發(fā)前景。

NRP1的基礎(chǔ)生物學(xué)

神經(jīng)纖毛蛋白（neuronilins，NRPs）是一種單次跨膜、非酪氨酸激酶表面糖蛋白，在所有脊椎動(dòng)物中都存在，在物種間高度保守。已知存在兩種同源的NRP亞型，即NRP1和NRP2，由不同的基因編碼，這兩種NRP最初被發(fā)現(xiàn)為神經(jīng)元粘附分子。后來(lái)發(fā)現(xiàn)它們與血管生物學(xué)有關(guān)，正常胚胎血管發(fā)育需要NRP1和NRP2參與小淋巴管和毛細(xì)血管的形成。過(guò)去10年的研究表明，NRP是一種多功能蛋白質(zhì)，參與除神經(jīng)和血管發(fā)育以外的多種生物過(guò)程，其中NRP1起在免疫和腫瘤發(fā)生中起主要作用。

NRP1蛋白由一個(gè)長(zhǎng)的N端胞外結(jié)構(gòu)域組成，接著是一個(gè)跨膜區(qū)和一個(gè)由43－44個(gè)氨基酸組成的非常短的胞內(nèi)區(qū)。細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域由三個(gè)主要片段組成，即兩個(gè)CUB（補(bǔ)體C1r／C1s，Uegf，骨形態(tài)發(fā)生蛋白1）結(jié)構(gòu)域（表示為a1／a2）和兩個(gè)凝血因子V／VIII結(jié)構(gòu)域（表示為FV／VIII或b1／b2），然后是MAM（與meprin蛋白酶同源，A5抗原，受體酪氨酸磷酸酶μ和К）結(jié)構(gòu)域（表示為“c”）。CUB結(jié)構(gòu)域是連接信號(hào)素配基所必需的，而FV／VIII結(jié)構(gòu)域負(fù)責(zé)血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（VEGF）的結(jié)合以及不同配體（如信號(hào)素和VEGF）的對(duì)接位點(diǎn)。已知MAM結(jié)構(gòu)域介導(dǎo)受體的同源二聚或異源二聚。盡管最初人們認(rèn)為NRP1是一個(gè)非信號(hào)受體，因?yàn)樗�的胞�?nèi)區(qū)很短，但后來(lái)發(fā)現(xiàn)c端保守的PDZ（PSD－95／Dlg／ZO－1同源性）結(jié)構(gòu)域結(jié)合基序（SEA）與GAIP相互作用蛋白c－末端／synectin結(jié)合，后者介導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)信號(hào)傳遞和受體內(nèi)化。

NRP1能夠與廣泛的配體結(jié)合，解釋了其多樣的生物學(xué)功能。NRP1首先被確定為分泌的III類信號(hào)素的共同受體，如信號(hào)素3A（Sema3A），后來(lái)發(fā)現(xiàn)NRP1與多種生長(zhǎng)因子結(jié)合，最顯著的是VEGF1，以及其他包括轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β、血小板衍生生長(zhǎng)因子C和D、和C－Met。有趣的是，最近的研究表明，NRP1還與細(xì)胞外microRNA／AGO2復(fù)合物結(jié)合并促進(jìn)其內(nèi)部化，增加了NRP1調(diào)節(jié)細(xì)胞功能的另一種機(jī)制。

免疫系統(tǒng)中的NRP1

髓系細(xì)胞

NRP1在人類和小鼠的中樞神經(jīng)和血管系統(tǒng)中廣泛表達(dá)于多種組織和細(xì)胞中，而NRP1在免疫系統(tǒng)中的表達(dá)受到更多的限制和調(diào)節(jié)。NRP1被鑒定為人類樹(shù)突狀細(xì)胞（DC）的標(biāo)志物，稱為血液DC抗原4（BDCA4，或CD304），在所有漿細(xì)胞樣DC（pDCs）中均有表達(dá)。pDCs被稱為“專業(yè)的”I型干擾素（IFN）產(chǎn)生細(xì)胞型，當(dāng)用抗NRP1抗體治療時(shí)，顯示人類pDCs病毒感染時(shí)IFN－α釋放減少，提示NRP1在抗病毒免疫中具有免疫調(diào)節(jié)作用。其他表達(dá)NRP1的抗原呈遞細(xì)胞（APC）包括單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞，尤其是幾種組織內(nèi)的巨噬細(xì)胞，例如小膠質(zhì)細(xì)胞和脂肪組織巨噬細(xì)胞（ATM）。單核細(xì)胞／巨噬細(xì)胞NRP1的表達(dá)通常被認(rèn)為是促血管生成和抗炎的，因此有助于組織重塑和傷口愈合。在最近的一份報(bào)告中，發(fā)現(xiàn)NRP1＋ATM可通過(guò)維持葡萄糖動(dòng)態(tài)平衡來(lái)預(yù)防肥胖和代謝綜合征。

T細(xì)胞

在適應(yīng)性免疫中，NRP1被認(rèn)為是小鼠胸腺源性Treg（tTreg）細(xì)胞的標(biāo)記物，盡管這并不適用于人類Treg細(xì)胞。相反，NRP1在靜止的CD4＋輔助性T細(xì)胞和CD8＋T細(xì)胞上表達(dá)非常低。在抵抗實(shí)驗(yàn)性自身免疫性腦炎（EAE）的小鼠模型中，NRP1在EAE耐受性CD4＋T細(xì)胞（同時(shí)在Foxp3＋和Foxp3－）中上調(diào)，并在功能上促成其抑制表型。其他報(bào)告有NRP1表達(dá)的T細(xì)胞亞群包括T濾泡輔助細(xì)胞和IL－17表達(dá)的不變自然殺傷性T細(xì)胞。最后，NRP1在人類胸腺上皮細(xì)胞（TEC）上結(jié)構(gòu)性表達(dá)，在TEC與胸腺細(xì)胞接觸期間上調(diào)未成熟胸腺細(xì)胞，隨后被Sema3A阻斷以引導(dǎo)胸腺細(xì)胞遷移。

髓系細(xì)胞－T細(xì)胞相互作用

NRP1也由從人類外周血中分離出來(lái)的傳統(tǒng)樹(shù)突狀細(xì)胞表達(dá)，它可能通過(guò)同型相互作用介導(dǎo)樹(shù)突狀細(xì)胞和T細(xì)胞之間免疫突觸的形成來(lái)促進(jìn)早期T細(xì)胞啟動(dòng)。由于Treg細(xì)胞優(yōu)先表達(dá)NRP1，在沒(méi)有炎癥或外來(lái)抗原暴露的情況下，Treg細(xì)胞通過(guò)NRP1–NRP1相互作用使DC在免疫突觸上的作用時(shí)間更長(zhǎng)，這是一種維持免疫耐受處于穩(wěn)態(tài)的機(jī)制。此外，在移植的情況下，細(xì)胞膜蛋白從APCs轉(zhuǎn)移到T細(xì)胞，稱為trogocytosis，通過(guò)幾種已知的NRP1配體（如Sema3A和VEGF）使CD4＋T細(xì)胞對(duì)抑制信號(hào)敏感。此外，VEGF作為一種免疫抑制細(xì)胞因子，可以以NRP1依賴的方式抑制脂多糖誘導(dǎo)的DC成熟。

總之，很明顯，NRP1介導(dǎo)重要的免疫調(diào)節(jié)功能，包括自我耐受和免疫穩(wěn)態(tài)，類似于一些已知的IRs的活性。然而，NRP1與經(jīng)典IRs的區(qū)別在于，它對(duì)多種細(xì)胞類型，特別是免疫抑制細(xì)胞產(chǎn)生這樣的影響。這些特征強(qiáng)調(diào)了為什么在癌癥的背景下檢查NRP1的功能可能是改進(jìn)免疫治療的關(guān)鍵步驟。

NRP1在小鼠和人TME中的表達(dá)和功能

NRP1與癌癥之間已建立的聯(lián)系得到了三個(gè)關(guān)鍵的觀察結(jié)果的支持：（1）NRP1在多種人類癌癥類型的惡性細(xì)胞中高表達(dá)；（2）NRP1在TME中大量表達(dá)，包括基質(zhì)細(xì)胞和免疫細(xì)胞；（3）NRP1的表達(dá)通常與不良的臨床預(yù)后相關(guān)。從腫瘤細(xì)胞的角度來(lái)看，NRP1通過(guò)多種功能支持腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)，包括細(xì)胞存活、新生血管生成和轉(zhuǎn)移。

在腫瘤－免疫界面，NRP1通過(guò)在TME的免疫室中協(xié)調(diào)多種抑制過(guò)程來(lái)促進(jìn)免疫逃避。一方面，NRP1在樹(shù)突狀細(xì)胞和巨噬細(xì)胞中的生理作用，有助于這些細(xì)胞的抗炎表型，被腫瘤“劫持”以促進(jìn)腫瘤血管生成和腫瘤相關(guān)免疫抑制。另一方面，NRP1直接影響適應(yīng)性抗腫瘤免疫，這是通過(guò)調(diào)節(jié)腫瘤內(nèi)Treg細(xì)胞和CD8＋T細(xì)胞的細(xì)胞外和細(xì)胞內(nèi)抑制途徑來(lái)實(shí)現(xiàn)的。

Tregs細(xì)胞中的NRP1：穩(wěn)定性的守護(hù)者

NRP1在人體組織和免疫細(xì)胞亞群中的表達(dá)反映了在小鼠模型中的發(fā)現(xiàn)。最顯著的例外是Treg細(xì)胞。NRP1最初被認(rèn)為是小鼠tTreg細(xì)胞的標(biāo)記物，部分原因是它與Helios明顯共表達(dá)。事實(shí)上，小鼠Nrp1基因是Foxp3介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄調(diào)控的直接靶點(diǎn)，異位表達(dá)和染色質(zhì)免疫沉淀實(shí)驗(yàn)證明了這一點(diǎn)。隨后的研究表明，NRP1在血液或淋巴結(jié)中的人類外周Treg細(xì)胞上不表達(dá)。相反，健康的供體Treg細(xì)胞在體外激活時(shí)上調(diào)NRP1，表明免疫過(guò)程可能在體內(nèi)調(diào)節(jié)了NRP1的表達(dá)。盡管NRP1調(diào)控可能具有物種特異性的決定因素，但下面討論的結(jié)果表明其對(duì)Treg細(xì)胞表型和功能的影響仍然是保守的。

在癌癥的情況下，NRP1的Treg細(xì)胞表達(dá)通過(guò)至少兩個(gè)平行的途徑增強(qiáng)免疫抑制：通過(guò)充當(dāng)VEGF的共受體促進(jìn)Treg細(xì)胞向腫瘤募集，以及通過(guò)信號(hào)素－4A（Sema4a）維持腫瘤特異性Treg細(xì)胞的穩(wěn)定性。在Cd4CreNrp1L／L的NRP1敲除的小鼠腫瘤模型中，盡管大量Nrp1缺陷的Treg細(xì)胞在體外具有相同的抑制功能，但腫瘤內(nèi)CD8＋T細(xì)胞的比例和功能顯著增加。這導(dǎo)致在植入式和自發(fā)性腫瘤模型中提高了無(wú)瘤生存率并減緩腫瘤生長(zhǎng)。由于NRP1在血管生成中起到VEGFR2共受體的作用，研究表明NRP1＋Treg細(xì)胞在體外沿著VEGF梯度遷移。此外，在野生型小鼠中，通過(guò)皮下注射Vegf–／–纖維肉瘤腫瘤，與Vegf＋的腫瘤相比，在野生型小鼠體內(nèi)腫瘤生長(zhǎng)的減少可以重現(xiàn)。這些觀察結(jié)果強(qiáng)調(diào)了在腫瘤模型中，作為T(mén)reg細(xì)胞建立免疫抑制的關(guān)鍵成分，VEGF對(duì)Treg細(xì)胞的趨化反應(yīng)的重要性。

此外，除了細(xì)胞遷移外，NRP1對(duì)維持腫瘤內(nèi)Treg細(xì)胞功能和表型至關(guān)重要。通過(guò)抗體阻斷或Treg細(xì)胞特異性基因缺失（通過(guò)Foxp3CreNrp1L／L）破壞NRP1通路，阻礙了腫瘤內(nèi)Treg細(xì)胞抑制功能，從而恢復(fù)了抗腫瘤免疫，而避免了自身免疫的外周脫靶效應(yīng)。與Nrp1＋／＋野生型相比，Nrp1–／–腫瘤內(nèi)Treg細(xì)胞的Bcl2降低，活性caspase－3增加，表明生存路徑的失調(diào)。此外，Nrp1–／–瘤內(nèi)Treg細(xì)胞下調(diào)激活標(biāo)記物（包括Helios、IL－10、ICOS、CD73）而出現(xiàn)特征性T輔助細(xì)胞系標(biāo)記物（如Tbet、CXCR3、IRF－4和RORγT）。研究表明，NRP1定位于T細(xì)胞活化過(guò)程中的免疫突觸，通過(guò)磷酸酶和張力蛋白同源物（PTEN）抑制Akt（又稱蛋白激酶B或PKB）活性，從而減輕Akt介導(dǎo)的對(duì)Foxo1／3的拮抗作用，穩(wěn)定Treg細(xì)胞功能。后續(xù)研究表明，雖然腫瘤內(nèi)Nrp1缺陷的Treg細(xì)胞保留了Foxp3的表達(dá)，但出現(xiàn)促炎性表型和IFN－γ的增加，表明其抑制功能的喪失。有趣的是，Nrp1–／–Treg細(xì)胞產(chǎn)生IFNγ會(huì)引起鄰近Nrp1＋Treg細(xì)胞功能紊亂。在MC38腫瘤模型中，為了調(diào)節(jié)抗PD1的免疫治療，需要Treg細(xì)胞增加對(duì)IFNγ的敏感性來(lái)達(dá)到腫瘤清除的目的。事實(shí)上，攜帶缺乏IFN－γ受體的Treg細(xì)胞的小鼠對(duì)抗PD1不敏感。這些發(fā)現(xiàn)為進(jìn)一步研究NRP1作為治療藥物的拮抗作用提供了重要的臨床依據(jù)。

許多研究報(bào)告了癌癥患者的NRP1＋Treg細(xì)胞增多。這種Treg細(xì)胞表型在胰腺癌和結(jié)直腸癌肝轉(zhuǎn)移的外周血中也有報(bào)道。在慢性淋巴細(xì)胞白血病中，在患者血液中觀察到B細(xì)胞和Treg細(xì)胞上NRP1升高，在沙利度胺治療后減少。還有報(bào)道稱，在宮頸癌患者的腫瘤引流淋巴結(jié)（TDLN）中，NRP1＋Treg細(xì)胞增多，尤其是腫瘤轉(zhuǎn)移的TDLN。此外，人NRP1＋Treg細(xì)胞的功能更為抑制，F(xiàn)OXP3和糖皮質(zhì)激素誘導(dǎo)的TNFR相關(guān)蛋白（GITR）在NRP1＋Treg細(xì)胞中的表達(dá)增加。有趣的是，針對(duì)VEGF結(jié)合域的NRP1拮抗劑通過(guò)誘導(dǎo)NRP1蛋白內(nèi)化，使人腫瘤內(nèi)Treg細(xì)胞抑制降低約20％。最后，還有研究報(bào)告了外周血中NRP1＋Treg細(xì)胞的升高，原發(fā)性黑色素瘤和頭頸部鱗狀細(xì)胞癌患者的腫瘤中NRP1＋Treg細(xì)胞的比率與無(wú)病生存率呈負(fù)相關(guān)。這些發(fā)現(xiàn)共同支持了NRP1＋Treg細(xì)胞在癌癥中功能增強(qiáng)的觀點(diǎn)。此外，在癌癥患者外周血中觀察到NRP1＋Treg細(xì)胞的增加。這一發(fā)現(xiàn)在IRs中是唯一的，它們?cè)谘�液樣本中的表達(dá)往往很低，可能表明循環(huán)Treg細(xì)胞上的NRP1表達(dá)可作為臨床結(jié)果的預(yù)處理或治療預(yù)后生物標(biāo)志物。