前言

當免疫細胞遇到入侵的病原體時,它們能迅速激活強大的防御機制。然而,過度的免疫反應可能會產生有害影響。免疫細胞在多個檢查點受到各種分子和具有抑制功能的細胞的調節(jié),這些檢查點對于自我耐受的發(fā)展至關重要。然而,這樣的檢查點可能會被腫瘤和病原體劫持,從而逃離免疫系統(tǒng)的監(jiān)視。

以PD-1和CTLA-4為靶點的腫瘤免疫療法顯著改善了不同癌癥類型患者的預后,徹底改變了癌癥治療。這些治療方法的成功證實了抑制性共受體是免疫細胞不攻擊腫瘤細胞和自身組織的關鍵檢查點。然而,它們的應答率通常較低,免疫相關不良事件(irAEs)也在使用免疫檢查點抑制劑的患者中出現。這表明需要繼續(xù)破譯抑制性共受體的復雜生物學,以提高癌癥患者的響應率并防止不必要的副作用。

迄今為止,除了PD-1和CTLA-4外,還發(fā)現了許多刺激性和抑制性的共受體。這些共受體通過調節(jié)抗原受體信號的質量和數量來控制淋巴細胞的活化,從而在避免自身免疫和過度免疫反應的同時優(yōu)化針對腫瘤和病原體的免疫反應。在這些共受體中,淋巴細胞活化基因-3(LAG-3,CD223)是僅次于PD-1的首要靶點,目前正在進行多項臨床試驗來驗證LAG-3靶向治療作用。

LAG-3的分子特性

1990年,Triebel和他的同伴在一項篩選中發(fā)現了LAG-3。LAG-3是一種Ⅰ型跨膜蛋白,具有四個Ig樣結構域,稱為結構域1到結構域4(D1-D4)。LAG-3的胞外區(qū)與CD4的氨基酸同源性約為20%,CD4也由4個Ig樣結構域組成。此外,在大多數物種中,LAG-3基因位于CD4基因附近,因此,這些基因很可能是通過基因復制進化而來的。與細胞外區(qū)域的相似性相反,LAG-3和CD4的細胞內區(qū)域沒有明顯的相似性。LAG-3缺乏與淋巴細胞特異性蛋白酪氨酸激酶(Lck)相關所需的半胱氨酸基序和在CD4中觀察到的棕櫚�；�位點。

LAG-3的D1由9條β-鏈組成,它們被稱為A、B、C、C'、C”、D、E、F和G鏈。大約30個氨基酸的附加序列位于C和C'鏈之間,形成一個環(huán),稱為“額外環(huán)”。盡管序列相似性較低,但在人和小鼠LAG-3中都可以觀察到這個環(huán),據報道此環(huán)參與了LAG-3和主要組織相容性復合體II類(MHCII)之間的關聯。此外,LAG-3高度糖基化,在D2-D4中存在多個N-糖基化位點。Galectin-3和肝竇內皮細胞凝集素(LSECtin)被認為與LAG-3聚糖存在相互作用。

與CD4相比,D4和跨膜區(qū)之間的LAG-3區(qū)有一個較長的氨基酸序列稱為“連接肽”。基于小鼠模型,Li等報道了金屬蛋白酶ADAM10和ADAM17在CP處裂解LAG-3,并以可溶性形式釋放LAG-3胞外區(qū)域。LAG-3突變體能夠逃避金屬蛋白酶的切割,表現出更強的抑制作用。因此,ADAM10和ADAM17可能通過調節(jié)細胞表面LAG-3的數量來調節(jié)LAG-3的抑制作用。人與小鼠CP的氨基酸序列同源性較低。人類LAG-3是否也能被這些金屬蛋白酶裂解,還有待進一步研究。目前,可溶性LAG-3的功能尚不清楚。

LAG-3的表達

與PD-1和CTLA-4一樣,LAG-3在原始T細胞上不表達,但在抗原刺激下可在CD4+和CD8+T細胞上誘導表達。由于LAG-3的抑制功能與其在細胞表面的表達水平密切相關, LAG-3表達的調節(jié)非常關鍵。長期感染病毒、細菌、寄生蟲引起抗原的持續(xù)暴露,會導致CD4+和CD8+T細胞上LAG-3以及其他抑制性共受體的高水平持續(xù)表達。這些T細胞失去強大的效應器功能,被稱為衰竭性T細胞。LAG-3阻斷劑已被證明能使衰竭的T細胞恢復活力并增強抗感染免疫,盡管與PD-1阻斷劑相比,作用較小。腫瘤浸潤性T細胞也持續(xù)暴露于腫瘤相關抗原,并表達高水平的多種抑制共受體,包括LAG-3,導致功能衰竭。IL-2、IL-7和IL-12可增強活化T細胞的LAG-3表達。

LAG-3在具有抑制功能的CD4+T細胞亞群中也有表達。Foxp3+調節(jié)性T(Treg)細胞結構性地表達LAG-3。Zhang等人證明,LAG-3對Treg細胞的增殖具有內在的限制作用。LAG-3在Treg細胞效應器功能中的作用是有爭議的。Huang等人報告,LAG-3缺陷小鼠的Treg細胞以較低的效率抑制效應T細胞的激活,而其他研究表明,LAG-3缺陷Treg細胞的抑制功能是可比的。需要進一步的研究來闡明LAG-3與Treg細胞的實際作用。LAG-3在CD4+1型調節(jié)T細胞(Tr1)上也有表達,Tr1細胞通過分泌大量的IL-10表現出強大的免疫抑制活性。此外,表達LAG-3的CD4+CD25-Foxp3-T細胞產生IL-10和轉化生長因子(TGF)-β3,被認為是一種獨特的細胞群,具有調節(jié)功能。有趣的是,目前也觀察到產生IL-10的自然調節(jié)漿細胞表達LAG-3,LAG-3在這些非經典調節(jié)細胞的細胞外抑制功能中的作用尚不清楚,需要進一步的研究。

已知多種轉錄調節(jié)因子,如胸腺細胞選擇相關的高遷移率族蛋白盒(TOX)、活化T細胞核因子(NFAT)、核受體亞家族4A(NR4A)、干擾素調節(jié)因子4和B淋巴細胞誘導的成熟蛋白-1參與產生衰竭的T細胞。其中,NFAT、NR4A和TOX被證明在T細胞中過度表達時,與其他抑制性共受體一起,可以增加LAG-3的表達水平。早期生長反應基因2(EGR2)也被報道是誘導CD4+CD25-Foxp3-調節(jié)性T細胞中LAG-3表達的關鍵轉錄因子。另一方面,T細胞中表達的T-box(T-bet)被報道抑制LAG-3和其他抑制性共受體的表達,并維持慢性感染時CD8+T細胞的抗原特異性反應。除了轉錄調控外,LAG-3的細胞表面表達水平還受亞細胞轉運和蛋白水解裂解的調節(jié)。

LAG-3在CD3+CD4-CD8-T細胞、TCRαβCD8αα上皮內淋巴細胞、γδT細胞和NKT細胞上也有表達,據報道,其在活化NK細胞上的表達參與了對小鼠MHCI陰性靶細胞的殺傷作用。漿細胞樣樹突狀細胞和活化B細胞也在其細胞表面表達LAG-3。然而,LAG-3在這些細胞中的功能作用仍然知之甚少。此外,據報道LAG-3在神經元上也有表達,并作為α-突觸核蛋白纖維的受體。

LAG-3的配體

最近,MHCII反式激活因子(CIITA)被確定為LAG-3配體的關鍵調節(jié)因子。CIITA不僅誘導MHCII表達,還誘導MHCII輔助分子表達,包括CD74和H2-DM。MHCII的輔助分子有助于肽MHCII復合物(pMHCII)的形成和細胞表面分類,在傳統(tǒng)的抗原呈遞途徑中表現出穩(wěn)定的結構構象。LAG-3區(qū)分pMHCII的構象并選擇性地與穩(wěn)定的pMHCII結合。因此,LAG-3優(yōu)先抑制識別穩(wěn)定pMHCII的CD4+T細胞的激活。此外,也已證明LAG-3不與CD4競爭pMHCII結合。相反,LAG-3通過通過細胞內區(qū)域傳遞抑制信號抑制T細胞激活。

LAG-3的配體

如前所述,LAG-3表達于腫瘤衰竭的CD8+T細胞上,是腫瘤免疫治療的有效靶點。然而,LAG-3與pMHCII結合影響CD8+T細胞活化的機制尚未闡明。最近,研究發(fā)現當抗原提呈細胞除了表達同源的pMHCI外,還表達大量穩(wěn)定的pMHCII時,CD8+T細胞的活化受到弱抑制,這表明LAG-3也可以在一定程度上直接抑制CD8+T細胞。

到目前為止,除了穩(wěn)定的pMHCII外,還有其他幾種分子被報道為LAG-3的可能配體。如前所述,galectin-3和LSECtin已被證明與LAG-3上的聚糖相互作用。Galectin-3屬于Galectin家族,是一種由多種腫瘤細胞和腫瘤間質細胞分泌的可溶性半乳糖結合凝集素。LSECtin是C型凝集素家族的一員,主要在肝臟中表達。研究報道,在表達LSECtin的黑色素瘤細胞中,LAG-3抑制T細胞在抗CD3抗體刺激下產生IFN-γ。最近,Wang等人發(fā)現纖維蛋白原樣蛋白1(FGL1)是LAG-3的潛在配體。FGL1在正常生理條件下由肝細胞分泌,而一些腫瘤細胞也能高水平地產生FGL1。FGL1被證明可以使表達LAG-3的3A9 T雜交瘤細胞減少IL-2的分泌。還需要進一步的研究來闡明這些潛在配體是否以及如何獨立和/或協(xié)同地參與LAG-3的抑制功能。

除了免疫抑制作用外,LAG-3似乎在神經系統(tǒng)中也有明顯的作用。Mao等人報道LAG-3可以與α-突觸核蛋白纖維結合,這與帕金森病的發(fā)病機制有關。α-突觸核蛋白纖維與LAG-3的結合觸發(fā)了α-突觸核蛋白纖維的內吞作用、細胞間傳遞和神經毒性。

LAG-3的抑制機制

LAG-3的胞內區(qū)由大約60個氨基酸殘基組成,缺乏典型的抑制基序,如免疫受體基于酪氨酸的抑制基序。然而,它包含幾個氨基酸序列,這些氨基酸序列在不同的LAG-3物種中非常保守,而不與其他抑制性共受體共享。這些序列包括并列膜區(qū)的FSAL,中部區(qū)域的KIEELE,10-15個谷氨酸串聯重復序列,以及在C末端區(qū)域的傾向但不限于的脯氨酸(EX-repeat)。LAG-3抑制T細胞活化需要細胞內區(qū)域的信號傳遞,它可以通過這些序列傳遞不同的抑制信號。

LAG-3的抑制功能與其在細胞表面的表達水平密切相關,當評估小鼠LAG-3突變體在DO11．10t雜交瘤細胞抗原依賴性激活中的表達水平時,氨基酸替換和缺失對LAG-3的表達水平有顯著影響,FSAL序列中苯丙氨酸和亮氨酸被丙氨酸取代后,LAG-3的抑制能力顯著降低。此外,當FSAL序列的突變與EX-repeat的缺失相結合時,LAG-3的抑制能力完全喪失,相當于缺少了整個細胞內區(qū)域。有趣的是,EX-repeat的缺失并不影響LAG-3的抑制能力。這些結果表明LAG-3可能通過FSAL基序和EX-repeat轉導兩個獨立的抑制信號,然而這些信號的分子機制仍不清楚。進一步的分析有望描繪出這些基序獨立或協(xié)同調節(jié)T細胞活化信號通路的精確分子機制。

LAG-3在自身免疫中的作用

抑制性共受體在建立和/或維持自身免疫耐受中起著關鍵作用,其表現為PD-1和CTLA-4缺陷小鼠自發(fā)的自身免疫性疾病,靶向PD-1和CTLA-4的免疫檢查點抑制劑不僅激活腫瘤特異性T細胞,還激活自身反應性T細胞,以誘導組織毒性,稱為irAEs。與PD-1和CTLA-4不同,LAG-3缺陷本身不會導致非自身免疫傾向小鼠的自身免疫。然而,在非肥胖糖尿病(NOD)小鼠中,LAG-3的基因缺失或阻斷會加重1型糖尿病(T1D)。LAG-3缺陷NOD小鼠與年齡匹配的LAG-3豐富的NOD小鼠相比,胰島中自身反應性CD4+和CD8+T細胞加速浸潤。此外,LAG-3和PD-1復合缺陷小鼠會發(fā)生致命性自身免疫性心肌炎,表明LAG-3與PD-1協(xié)同作用,以預防自身免疫。

在實驗性自身免疫模型中,LAG-3被報道可以減輕自身免疫癥狀。Jha等報道LAG-3缺乏或阻斷通過抑制C57BL/6．H2s小鼠對汞的耐受性,增加了對汞誘導的自身免疫的易感性。在髓鞘少突膠質細胞糖蛋白(MOG)誘導的實驗性自身免疫性腦脊髓炎(EAE)模型中,kadovaki等人證明LAG-3阻斷劑消除了腸道環(huán)境誘導的上皮內MOG特異性CD4+T細胞的抗炎作用。Kim等還報道了體外誘導的Treg(iTreg)細胞拯救Treg耗竭小鼠致死EAE的能力依賴于iTreg細胞上LAG-3的表達。

鑒于LAG-3在自身免疫中的重要調節(jié)作用,LAG-3有望成為炎癥和自身免疫性疾病的治療靶點。已開發(fā)出具有ADCC活性的人源化抗LAG-3抗體(GSK2831781),通過清除可能包括致病性自身反應性T細胞的LAG-3+T細胞來治療自身免疫性疾病。此外,抗LAG-3激動劑抗體(IMP761)通過誘導LAG-3的抑制作用,在體內外均有免疫抑制作用。

LAG-3在抗腫瘤免疫中的作用

如前所述,LAG-3在衰竭的CD4+和CD8+腫瘤浸潤性T細胞上表達,這些T細胞在黑色素瘤、結直腸癌患者的外周血和腫瘤組織中也有表達,這種表達LAG-3的Treg細胞產生高水平的免疫調節(jié)細胞因子IL-10和TGF-β,并抑制腫瘤特異性T細胞。一直以來,腫瘤中LAG-3表達水平和LAG-3+細胞浸潤與腫瘤進展、預后不良和各種類型的人類腫瘤相關。這些結果強烈表明,LAG-3參與了類似PD-1的腫瘤免疫逃逸機制。因此,LAG-3被認為是腫瘤免疫治療的一個有前途的治療靶點,動物模型的研究也證實了這一點�？筁AG-3抗體延緩腫瘤生長的研究已在HNSCC和纖維肉瘤的小鼠模型中被報道。Grosso等人證明,結合抗LAG-3抗體和接種腫瘤相關抗原的組合療法增加了腫瘤中活化的CD8+T細胞的數量,并在前列腺癌的腫瘤耐受模型中破壞了腫瘤實質。然而,在聯合治療或單獨接種的小鼠之間,腫瘤等級沒有顯著差異。

LAG-3與PD-1協(xié)同抑制抗腫瘤免疫和自身免疫。在上皮性卵巢癌患者中,Matsuzaki等人觀察到大約80%佛如LAG-3+和50%的LAG-3-腫瘤浸潤CD8+T細胞表達PD-1。他們還報道了LAG-3和PD-1的聯合阻斷增強了腫瘤相關抗原NY-ESO-1體外刺激腫瘤浸潤的CD8+T細胞的增殖和細胞因子的產生。在B16黑色素瘤、MC38結腸腺癌、Sa1N纖維肉瘤和復發(fā)性黑素瘤等多種腫瘤模型中也觀察到LAG-3和PD-1在腫瘤浸潤的CD4+、CD8+T細胞上的共表達以及LAG-3和PD-1基因復合缺失的強治療作用。盡管LAG-3阻斷劑有望激活腫瘤特異性CD4+和/或CD8+T細胞,但它也可能增加Treg細胞的數量,LAG-3被報道可以限制Treg細胞的增殖。根據Goding等人的研究,在復發(fā)性黑色素瘤模型中,Treg細胞被LAG-3和PD-1共同阻斷而減少。還需要進一步的研究來闡明LAG-3對Treg細胞和效應T細胞數量和功能的確切影響。

在這些研究中,抗LAG-3ab作為單藥治療時產生了一定的治療效果,但顯著增強了抗PD-1抗體的治療效果。這兩種分子的抑制機制和/或表達譜的差異很可能解釋了它們的功能協(xié)同作用。LAG-3與PD-1協(xié)同或加性作用的確切機制尚需進一步研究。

LAG-3的臨床開發(fā)

基于臨床前的觀察,尤其是與針對PD-1的藥物聯合使用帶來的益處。到目前為止,已經開發(fā)出至少13種針對LAG-3的藥物。包括抗LAG-3阻斷性抗體(relatlimab(BMS-986016)、Sym022、TSR-033、REGN3767、LAG525、INCAGN2385-101、MK-4280和BI754111)以及拮抗雙特異性抗體(MGD013(抗PD-1/LAG-3)、FS118(Anti-LAG-3/PD-L1)和XmAb22841 (anti-CTLA-4/LAG-3))。

到目前為止,只有少數針對LAG-3和PD-1的組合療法的中期報告�？筁AG-3抗體作為單藥治療的實際療效或抗LAG-3抗體在PD-1和LAG-3聯合治療中的確切加性效應有待進一步的報道。在I/II期研究中(NCT0198609),評估了relatlimab聯合抗PD-1抗體(nivolumab)治療晚期黑色素瘤患者的安全性和有效性,這些患者在先前的抗PD-1或抗PD-L1免疫治療中有進展,relatlimab與nivolumab聯合應用耐受性良好,61例患者的客觀緩解率(ORR)為11．5%。腫瘤邊緣內至少1%的腫瘤相關免疫細胞中LAG-3表達的患者(n=33)的ORR至少比LAG-3表達低于1%的患者(n=22)高3．5倍(分別為18%和5%)。在I/II期研究(NCT02460224)中,LAG525聯合抗PD-1抗體(spartalizumab)在9．9%的患者中(n=121)表現出持久的反應,包括間皮瘤(8例患者中的2例)和三陰性乳腺癌(5例中有2例)。這種抗LAG-3抗體的確切作用機制仍有待研究。尤其是對抗LAG-3治療中靶細胞的檢測以及闡明抗LAG-3和抗PD-1治療協(xié)同作用的機制,是合理設計療效最大、副作用最小的抗LAG-3治療方案所必需的。

其他LAG-3靶向藥物也被用于癌癥治療。IMP321是一種可溶性重組融合蛋白,由LAG-3的胞外區(qū)和IgG的Fc區(qū)組成,通過MHCII介導反向信號激活抗原提呈細胞,導致IL-12和TNF的增加,CD80和CD86的上調。在目前進行的臨床試驗中,IMP321單藥治療或與其他療法聯合治療的療效一般。通過MHCII反向信號的細節(jié)仍然未知,需要仔細研究。

抗-LAG-3消耗抗體(GSK2831781)和激動劑抗體(IMP761)作為治療自身免疫性疾病的潛在治療劑也有報道。盡管這些抗體旨在清除或抑制致病性T細胞,但它們也可能消耗或抑制Treg細胞。進一步的研究闡明這種抗體的功能以及LAG-3的生物學特性有望促進其發(fā)展。

展望

靶向抑制性協(xié)同受體PD-1和CTLA-4的檢查點免疫療法徹底改變了癌癥治療,而LAG-3作為新一代發(fā)現的抑制性檢查點,有望成為腫瘤治療中極具前景的靶點。然而,我們對LAG-3的理解仍然非常有限,許多基本問題仍然沒有得到解答。LAG-3的信號轉導機制尚不清楚,其配體也很復雜。LAG-3在多種細胞中表達,然而,LAG-3的功能以及LAG-3阻斷劑在每種類型細胞中的作用尚未闡明。我們還需要研究LAG-3和其他共受體的功能差異、冗余和協(xié)同作用。通過更詳細地闡明LAG-3的功能特性,我們才可以合理地設計LAG-3靶向治療各種疾病,如癌癥和自身免疫疾病。

參考文獻:

1． LAG-3: from molecular functions to clinical applications． J Immunother Cancer． 2020 Sep;8(2):e001014．

2． clinicaltrials．gov