2．CD8 + T細胞具有連續(xù)分化軌跡

接下來對CD8 + T細胞進行了生物信息學分離并重新聚類,得到了8個亞群(圖2A)。TIL的CD8 + T最常見于#1-4,而PBMC和tonsil的CD8 + T細胞常見于#5-8(圖2B)。圖2C為每個亞群的差異基因。

圖2C得:#1與細胞周期細胞(eg． MKI67)相關;#2與干擾素應答基因(eg． ISG15)相關;#3和4與檢查點標記(eg． PDCD1,CTLA4和HAVCR2)相關;#5表達較為靜止;#6與幼稚或記憶細胞(eg． CCR7和CD27)有關;#7與早期激活相關(eg． JUNB和FOSB);#8表達與效應功能有關(例如,KLRG1和GZMH)。

接下來,使用自主開發(fā)的新R包SingleSeqGset(https://github．com/arc85/singleseqgset)中進行競爭性基因集富集測試(competitive gene set enrichment test),評估了亞群的生物學功能。其中,#4缺氧反應有富集,而先前已經(jīng)證實缺氧誘導因子可增強CD8 + T細胞效應,這表明該亞群抗腫瘤活性更高。

接下來,使用R包Destiny進行擴散映射分析(diffusion map analysis)來推斷分化軌跡。結(jié)果顯示出一條無分叉平滑軌跡(圖2E),HPV +和HPV- TIL也有重疊(圖2F)。因為DC1與抑制性受體表達以及腺苷代謝增強有關,所以認為DC1與終末分化表型密切相關 �？偟膩碚f,這個部分鑒定出CD8 + T各亞群功能,并根據(jù)HPV +和HPV-之間共有的分化軌跡,推斷針對CD8 + T細胞的免疫治療策略可能均適用于兩種HNSCC。

圖2．CD8 +T的HPV–和HPV + TIL分化軌跡以及抑制性受體的共表達

3．CD4 + Tconv的異質(zhì)性和分化軌跡

接下來比較了HPV–和HPV + HNSCC之間CD4 + T細胞的轉(zhuǎn)錄情況,分別分析了CD4 + Tconv細胞和CD4 + Treg細胞。CD4 + Tconv細胞聚類出7個不同的亞群(圖3AB),#1和6大部分由HPV + TIL和tonsil組成,HPV– TILs則分布在#4和7之間�；�因富集發(fā)現(xiàn)tonsil和TIL中的CD4 + Tconv細胞顯示出T濾泡輔助功能(TFH)和1型輔助功能(TH1)的富集,且HPV +與HPV– TIL相比,具有顯著的細胞富集,說明HPV + T細胞的效應功能更強。

圖3C為CD4 + Tconv細胞的分化軌跡,不同于CD8 + T細胞,擴散圖的前3維產(chǎn)生了分支軌跡(圖3C),且發(fā)現(xiàn)HPV–和HPV + TIL的分化平面顯著不同(圖4D)。接下來將擴散擬時間(pseudotime,DPT)作為第三維與DC1,DC2一起分析,DC1和DC2都與DPT正相關。與基因集富集分析一致,#2是最幼稚的亞群,然后通過連續(xù)的中間表型,向#1或#7終態(tài)發(fā)展。圖3E顯示了#1和7的差異基因表達,#1與TFH有關,#7與記憶性功能有關。CXCR5和PDCD1與DC1的表達有關,還發(fā)現(xiàn)了其他已知抑制性受體(LAG3和HAVCR2)在CXCR5和PDCD1共表達時明顯表達。這表明了早期階段的命運決定模式,過程中細胞可以發(fā)展為CD4 + TFH或者通過抑制受體共表達,從而潛在地抑制進一步分化。

圖3．A-E CD4+ Tconv的轉(zhuǎn)錄狀態(tài)和分化軌跡的分析

4．CD4 + Treg細胞中與IFN和TNFR相關的信號

CD4+ Treg細胞能抑制抗腫瘤免疫反應,其細胞聚類發(fā)現(xiàn)了6個亞群(圖3FG),主要由TIL細胞構(gòu)成。接下來,進行了基因集富集分析,以表征每個亞群的生物活動(圖3H)。#2和4與IFNα應答相關,#3和6與TNFR家族信號通路相關,表明這些細胞根據(jù)其分化狀態(tài)對不同的信號作出反應。

CD4 + Treg細胞的擴散映射圖顯示DPT與DC1密切相關(圖3I)。沿著DC1軸,HPV–與HPV + TIL Treg細胞的密度存在細微差異,在早期DPT處,來自HPV– TIL的Treg細胞更多(圖3J)。

然后還發(fā)現(xiàn)TNFR與DC1正相關,并在晚期DPT表達。相反,IFN反應基因IFITM1,IFIT1,IFIT3和ISG20在早期DPT時表達,并隨著偽時間的進展而靜止,表明IFN信號在Treg細胞的早期活化中具有潛在作用。綜上所述,該分析表明,Treg細胞在HPV–和HPV + HNSCC之間具有相似的軌跡,并且在分化過程中IFN相關信號和TNFR家族信號相關,提示靶向Treg細胞的早期激活過程可以使用基于IFN的治療,而晚期激活的Treg細胞可能對TNFR介導的信號傳導更敏感。

圖3．F-J CD4+ Treg細胞的轉(zhuǎn)錄狀態(tài)和分化軌跡的分析