今天，我們非常有幸邀請到丹麥Ferring Pharmaceuticals擔任首席科學家楊翼博士在“肽研社”公眾號平臺進行分享。

楊翼博士

德國比勒菲爾德大學博士

Ferring Pharmaceuticals

首席科學家

楊翼博士于2008年在德國比勒菲爾德大學獲得博士學位，并于同年加入位于瑞士 Visp的LONZA AG，從事多肽原料藥的工藝開發(fā)與GMP生產。楊翼博士如今在丹麥Ferring Pharmaceuticals擔任首席科學家，負責公司多肽藥物的項目管理、工藝研發(fā)、優(yōu)化、驗證、GMP生產監(jiān)督，以及Lean Six Sigma項目。

楊翼博士擁有豐富的多肽工業(yè)生產經驗，在多肽藥物合成路線設計、QbD指導的生產工藝開發(fā)、優(yōu)化和驗證、多肽副反應與雜質研究，PGI （潛在基因毒性雜質） 管理、多肽藥物GMP生產與項目管理，多肽化學創(chuàng)新等領域有頗多建樹，多次在國際會議上做關于多肽化學與多肽GMP生產的學術報告。楊翼博士擁有Lean Six Sigma黑帶認證。

楊翼博士撰寫，由Elsevier出版社出版的Side Reactions in Peptide Synthesis（多肽合成副反應）一書是多肽化學領域第一本系統(tǒng)性論述多肽合成副反應的專著，廣受行業(yè)贊譽。目前楊翼博士正在準備另一本關于多肽化學不穩(wěn)定性和降解的學術專著，有望成為多肽藥物分子設計、多肽化學生產以及多肽藥物制劑領域的指導。

前     言

自從2018年纈沙坦類藥物因二甲基亞硝胺雜質超標被召回后，亞硝胺這個潛在致癌物再次成為制藥業(yè)頭頂上的達摩克利斯之劍，威脅著藥品的質量與患者的安全。

亞硝胺指的是包含R1R2N－N＝O結構的化合物，其中R1， R2通常為烷基。亞硝胺的遺傳毒性和致癌潛力早在50多年前便浮出水面。2020 年 9 月，F(xiàn)DA 發(fā)布了制藥行業(yè)關于控制藥品中亞硝胺雜質的指南。FDA 數(shù)據庫顯示，由于存在一定水平的可能致癌物亞硝胺雜質（超過 26．5 ng／天的可接受攝入量限制），在過去的兩年內已從市場召回超過 1400 批產品。召回產品中存在的藥物包括纈沙坦、厄貝沙坦、氯沙坦、二甲雙胍、雷尼替丁和尼扎替丁 （圖1）。

圖1．部分因亞硝胺雜質被召回的藥物化學結構式

何亞硝胺的遺傳毒性和致癌性

亞硝胺類化合物屬于“關注類”高誘變致癌物，該類物質已被世衛(wèi)組織國際癌癥研究機構IARC歸入可能是人類致癌物類別。大多數(shù)亞硝胺對于非人類動物都是致癌物。

美國藥品研究與制造商協(xié)會 （PhRMA） 根據化合物與DNA反應的活性，將所研究的化合物分為三類，即I類、II類和III類。含有 N－羥基、N－�；�的芳香胺類化合物和 N－氧化物的芳香胺屬于 I 類。II 類物質包括醛、羥烷基胺、N－亞硝胺，硝基化合物、氮丙啶、環(huán)氧化物、丙內酯、丙磺內酯、氨基甲酸酯、肼和偶氮化合物。III類物質包括邁克爾加成反應的受體、膦酸酯、磺酸酯、鹵代烷、鹵代烯烴和烷基／芳基鹵化物 （圖2）。在該分類中，亞硝胺被分在II類，說明其具備相當?shù)腄NA的反應活性。

圖2． 根據與DNA反應活性的化合物分類。

（圖片來源：Journal of Medicinal Chemistry）

根據國際癌癥研究機構對各種致癌物致癌性的研究，他們將亞硝胺物質按照人類致癌性標準分為四組。第 1 類亞硝胺具有“對人類致癌”的充分證據 （NNN 與 NNK）。2A 類亞硝胺“可能 （probably） 對人類致癌”，因其針對人類致癌性的數(shù)據有限，但在實驗動物身上有足夠的證據。2B 類亞硝胺“或許（possibly）對人類致癌”，在人類和實驗動物中獲取的證據都比較有限。剩下的數(shù)據不足的亞硝胺化合物，則被歸為第3類“不能歸類為人類致癌性的物質” （圖3）。

圖3． 國際癌癥研究機構的亞硝胺致癌性分類。

（圖片來源：Journal of Medicinal Chemistry）

如同亞硝酸鹽一樣，亞硝胺本身并不直接導致誘變性和致癌性。如圖4所示，攝入體內的亞硝胺類物質1，在細胞色素P450（cytochrome P450）的作用下被氧化為α－羥基亞硝胺 2 （此過程需要亞硝胺底物含有Hα，沒有Hα的取代亞硝胺不發(fā)生這個羥基化過程，因此可能不具誘變性及致癌性）。后者通常不穩(wěn)定，消除一個醛分子并轉化為1－羥基－2－烷基二亞胺3。化合物3經過脫水產生烷基重氮鹽（diazonium）4，這個不穩(wěn)定的重氮鹽在釋放一分子氮氣后轉化為高活性的碳正離子5。在這個過程中形成的碳正離子，可以說是亞硝胺化合物遺傳毒性和致癌性的直接兇手。由于高度的親電性（NDMA形成的碳正離子為甲基正離子，具有比其它烷基正離子更高的活性），碳正離子5 作為一個高效的烷基化試劑進攻蛋白質和DNA上的眾多親核基團，產生烷基化的結果。DNA中電子富集的堿基具有高親核性，因此成為了高親電碳正離子主要的進攻目標。例如，碳正離子可以親電進攻鳥嘌呤Guanine的N7位置（N7G），使之成為烷基化鳥嘌呤，同樣可以進攻鳥嘌呤的O6 （O6G）和胸腺嘧啶Thymine的O4（O4T）。這些堿基在遭受了烷基化改性之后，形成了穩(wěn)定的烷基化堿基，從而導致了可能的誘變性和致癌性。除此之外，在亞硝胺生物轉化過程種產生的醛，也可能帶來遺傳毒性或致癌性。比如NDMA釋放的甲醛，被世衛(wèi)組織和美國衛(wèi)生與公共服務部認定為“人類致癌物”。作為一種已知的交聯(lián)劑，甲醛可以通過亞甲基橋介導堿基對之間的交聯(lián)反應，從而激發(fā)潛在的致癌性。因此，NDMA和其它亞硝胺也因為其誘導的DNA兼濟烷基化和醛生成， 而被視為“雙重致癌物”。1，2

強效亞硝胺如 NDMA 和 NDEA 的DNA 損傷特異性仍不清楚，但已確定它們會產生促誘變 O6－烷基鳥嘌呤加合物（即通過添加小烷基如 －CH3 對鳥嘌呤進行修飾），由此誘發(fā)的烷基化鳥嘌呤最常通過 DNA 烷基轉移酶 （AGT，也稱為甲基－鳥嘌呤－甲基－轉移酶，MGMT） 進行脫烷基化修復。其他亞硝胺如 NDBA、NDELA、NMEA、NNK 和 NNN 也已知會產生 O6－烷基鳥嘌呤加合物。MGMT酶的活性在人體內具有高度差異。一項小型研究表明，人類結腸黏膜中 MGMT 的活性變差為 6 至 7 倍。在嚙齒動物細胞系（例如大鼠肝臟）中，與人類細胞系相比，MGMT 修復酶是可誘導的。這可能表明大鼠和人類之間在解毒方面的潛在差異，因此以動物模型推算亞硝胺對人的致癌性可能是不準確的。

圖4． 亞硝胺生物體內轉化為碳正離子，以及碳正離子修飾DNA的生化過程。

亞硝胺雜質產生的根源分析

沙坦類藥物在化學結構上最顯著的共同點在于四唑環(huán)。在沙坦類藥物的合成中，四唑的環(huán)化是由有機腈與疊氮化鈉的環(huán)加成反應在高沸點溶劑（如二甲基甲酰胺或者N－甲基吡咯烷酮）中實現(xiàn)的，反應結束后，過量的疊氮化鈉用亞硝酸鈉淬滅。然而在這個特過程中使用的二甲基甲酰胺和N－甲基吡咯烷酮中分別含有二甲胺和4－甲氨基丁酸雜質（這些雜質即可能是這些溶劑的合成原料，也可能是溶劑分子降解的產物）。這些仲胺在疊氮化鈉的淬滅反應中與淬滅劑亞硝酸鈉作用，產生了相應的亞硝胺NDMA （二甲基亞硝胺） 和NMBA （N－亞硝基－N－甲基－4－氨基丁酸）。這個過程是沙坦類藥物產生亞硝胺雜質的根本原因（圖5）。尤其是考慮到疊氮化鈉淬滅可能是整個沙坦合成工藝的最后一步，產生的亞硝胺雜質污染最終產品的可能性大大增加。吡格列酮案例中二甲基亞硝胺（NDMA）形成的機理類似于沙坦，不同的是， 亞硝酸鈉與而二甲基甲酰胺并不出現(xiàn)在同一步反應中，而是上一步的亞硝酸鈉被部分攜帶到二甲基甲酰胺的步驟，從而與二甲胺雜質反應，形成了亞硝胺雜質。

圖5． 四唑環(huán)化，疊氮化鈉淬滅，以及DMF／NMP介導的亞硝胺形成反應。

綜合來看，在藥物生產（包括原料藥與成品藥）中產生亞硝胺雜質的可能來源包括，但不限于以下幾個方面：

· 在同一步或者不同步的工藝步驟（例如發(fā)生殘留物轉移）中，在存在仲胺或叔胺或季銨鹽的情況下使用亞硝酸鈉。

· 在同一步或者不同步的工藝步驟，將亞硝酸鈉與易降解為仲胺或叔胺的試劑、溶劑和催化劑結合使用（例如二甲基甲酰胺和N－甲基吡咯烷酮中的二甲胺和4－甲氨基丁酸雜質／降解物）。

· 在活性藥物成分 （API） 制造過程中使用受污染的原材料。

· 回收材料（例如溶劑）的使用。包括外包第三方的回收原料，而操作方并不清楚待回收原料中的雜質組成成分。以及在非專用設備中進行的常規(guī)回收過程。

· 使用由供應商提供的受污染的原材料和中間體，這些供應商使用的工藝或原材料可能會形成亞硝胺。而制造商并不清楚這些原材料和中間體的詳細雜質構成。

· 由于在同一條生產線上運行的不同工藝以及與操作員相關的錯誤導致的交叉污染事件。

· 起始材料、中間體和原料藥的降解過程，包括由固有反應性和亞硝酸鈉殘留引起的降解過程（可能在成品要生產過程或儲存期間發(fā)生）。

· 使用某些包裝材料。

多肽類藥物與亞硝胺雜質的相關性

目前尚未有多肽類藥物因為亞硝胺雜質超標而引發(fā)的藥物召回事件。但2018年的沙坦類藥物召回事件，已經促使包括FDA和EMA在內的眾多藥監(jiān)機構加大了亞硝胺雜質形成的風險評估要求。包括多肽類藥物制造商和CMO都已經接受到了各自藥監(jiān)部門的要求，對其生產工藝形成亞硝胺雜質的可能性做出徹底詳盡的調查分析。

常規(guī)的多肽類藥物固相合成的工藝中并不過多涉及亞硝酸鹽或者亞硝酸酯類的原料。某些使用�；�疊氮法液相合成多肽，或者進行多肽片段縮合的工藝會使用亞硝酸鹽，將酰肼前體 （通常由酯經過肼解反應制備） ，經過氧化亞硝酸化過程轉化為酰基疊氮化合物，并與對應的氨基化合物進行縮合，完成目標酰胺鍵的構造（圖6）。3

圖6． �；�疊氮法合成多肽的化學反應。

酰基疊氮曾經是多肽合成最初期常用的縮合方法，盡管這種工藝存在反應速率慢的內在問題，但由于酰基疊氮在與氨基縮合過程中很低的消旋化副反應，因此仍然作為一種有效的手段介導易于遭受消旋化的多肽片段縮合反應。由于歷史原因，很多早期獲批上市的多肽藥物是通過液相合成的方式生產的，因此至今仍在沿用看上去已經有些過時的�；�疊氮法液相片段縮合工藝。在該工藝中，N－端的片段在通常在液相中制備，因此其C端基團通常為酯 （通常是甲酯） 保護基團（以避免液相反應中的副反應）。在液相合成片段完畢后，利用肼將多肽片段的酯基團轉換為相應的酰肼，后者再被亞硝酸鹽氧化，得到亞硝基酰肼中間體，并脫水得到�；�疊氮多肽。這個含有�；�疊氮結構的N端多肽片段，在接下來的液相片段縮合反應中，與C－端片段的Nα進行縮合反應，制備完整肽鏈（圖7）。

由于在這個過程中使用了亞硝酸鈉作為反應試劑，因此產生亞硝胺雜質的風險極大。因此，對于含有此類反應的多肽合成工藝，需要對其進行徹底的風險評估，必要的時候應該使用已驗證的分析手段，對于中間品，粗品，或者純品進行亞硝胺的檢測。除此之外，也要對亞硝酸鹽進行同樣的風險評估，因為亞硝酸鹽如果被攜帶到了最終的產品，那么將有可能在接下來的制劑步驟，甚至產品儲存階段，與藥物分子或者賦形劑，亦或產品中雜質的仲胺進行反應，生成亞硝胺雜質。我在審閱制造商的風險評估報告中，就發(fā)現(xiàn)了他們只對亞硝胺的生成、攜帶和清除做了分析評估，卻完全忽略了亞硝酸鈉的數(shù)據，這是一個巨大的漏洞。

圖7． 酯－酰肼－亞硝基酰肼－�；�疊氮轉化過程介導的多肽液相縮合反應

多肽化學中另一個可能與亞硝胺雜質牽扯上的物質是縮合試劑添加劑oxyma。由于它更好的熱穩(wěn)定性與不易爆炸的特點，oxyma在工業(yè)領域已經逐漸取代了傳統(tǒng)的HOBt，成為了默認的多肽縮合試劑添加劑，與DIC共同使用介導常規(guī)的氨基酸縮合反應。Oxyma的生產工藝中可能使用亞硝酸作為反應物（圖8）。對于那些在上游合成的最后一步為液相反應，且使用oxyma作為原料的案例來說，需要注意可能攜帶的亞硝酸（鹽）。通常的oxyma的Certifate of Analysis（CoA）中并不包含亞硝酸或者亞硝酸鹽雜質的含量，但隨著監(jiān)管部門對于藥物亞硝胺控制趨于嚴格，多肽藥物制造商應該獲取oxyma的生產工藝以及包含亞硝酸（鹽）的CoA。

圖8． Oxyma合成路線

整體看來，常規(guī)的多肽合成，尤其是固相多肽合成，形成亞硝胺雜質的可能性極低，因為在反應中并不涉及亞硝化反應物。即便產生了痕量亞硝胺或者亞硝酸鹽，也會在液相色譜純化的步驟被清除。需要注意的是那些使用酰肼制備�；�疊氮的多肽藥物生產工藝，不僅要檢測亞硝胺的形成與清除，也要監(jiān)控亞硝酸鹽在這個過程中的轉化，清除與殘留。

亞硝胺雜質在多肽藥物合成的另一來源是有機溶劑。多肽合成的常規(guī)有機溶劑DMF與NMP中可能含有不同含量的二級胺雜質，也是NDMA與NMBA亞硝胺產生的前體，它們在亞硝化試劑的存在下可能產生亞硝胺雜質，這也是沙坦類藥物亞硝胺污染事件的根源。除此之外，使用來源不明的再利用有機溶劑，其中可能會含有亞硝胺或者亞硝酸鹽類物質，也會對多肽藥物合成造成潛在的威脅。

多肽藥物亞硝胺雜質應對策略

美國藥典公約 （USP） 于 2022 年 2 月 28 日，3 月 2 日和 3 月 4 日舉辦了關于治療性肽和寡核苷酸的年度研討會，有幾場演講側重于多肽雜質控制策略，亞硝胺雜質首當其沖地成為了從業(yè)者的關注點。Bachem在該研討會中闡述了他們控制多肽藥物生產中亞硝胺產生風險的理念。他們認為，為了控制制造過程中產生亞硝胺雜質的潛在風險，在工藝開發(fā)過程中需要一種控制策略，以便將亞硝胺形成或污染的潛在原因降至可接受的水平。失效模式和影響分析 （Failure Mode Effect Analysis， FMEA） 是進行此類復雜的多參數(shù)風險分析的理想工具。

FMEA 中的失效模式（Failure Mode）包括：

· 試劑和原料中含有胺結構的物質 （仲胺與叔胺是產生亞硝胺的反應物之一）

· 試劑和原料中亞硝酸鹽污染的風險 （亞硝酸鹽是產生亞硝胺的另一反應物）

· 試劑、原料、二級反應，或產品接觸表面被直接污染亞硝胺的風險

每個單獨產品的 FMEA 均基于 ICH Q9（質量風險管理）和 ICH M7（R1）（致突變雜質）條例制定的，其中最終 API 中亞硝胺的風險取決于遞進的三個參數(shù)：

· 失效模式概率 （PRN FM）： 對應以上三種失效模式發(fā)生的可能性

· 失效模式導致亞硝胺生成的概率 （PRN NA）：失效模式一旦產生，其導致亞硝胺產生的可能性

· 生成的亞硝胺被帶入 API的概率（PRN API）： 亞硝胺一旦產生，其無法被工藝清除而污染最終產品的可能性

每個失效模式所蘊含的嚴重性通過“嚴重性系數(shù) Severity Number （SN） ”＝ PRN FM x PRN NA來表征。而每個單個失效模式相關聯(lián)的風險由“風險系數(shù) Risk Number （RN）” ＝ SN x PRN API 定義，然后根據風險系數(shù)的具體數(shù)值，以及人為建立的檔次標準，將每個失效模式對應的亞硝胺生成進一步分類為 （i） 無風險，（ii） 極低風險，（iii） 低風險，（iv） 中等風險，以及 （v） 高風險，每個風險都需要采取適當?shù)男袆印?/p>

Bachem 的 FMEA 方法進一步建議組建一個 FMEA 小組，其成員包括來自制造部門的具有評估產品專業(yè)知識的 SME、QA 部門的成員和采購部門的成員，小組的活動是為了：

· 確定每個設施的試劑來源（每個 FMEA 都是特定于產品和制造設備）。

· 生成特定于產品的材料清單，并獲取制造商關于材料可能含有亞硝胺、硝酸鹽或其他可疑前體的風險的聲明。

· 審查在現(xiàn)場使用亞硝酸鹽的任何內部產品和流程。檢查 EPR 系統(tǒng)中是否存在這些試劑。

· 評估和判斷固相多肽合成的洗滌工藝以及 HPLC 純化去除亞硝胺雜質的潛力，以防止亞硝胺雜質進入最終 API。

其他降低污染風險的建議包括：

· 定期使用制備型 HPLC 通過早期識別來降低亞硝胺殘留進入 API 的風險。

· 使用新鮮的試劑和溶劑可以避免回收過程可能帶來的潛在污染風險。

總結

自從2018年沙坦類藥物檢測出亞硝胺雜質而引發(fā)大面積藥物召回事件后，各大藥品監(jiān)管部門都明顯提高了對亞硝胺雜質產生的風險評估要求，并加大了在此領域的質量分析力度。除了含有四唑結構的各類沙坦藥物被召回之外，不含此結構的雷尼替丁、奧芬那君等藥物因為藥物分子本身產生的亞硝胺雜質（NDSRI，nitrosamine drug substance related impurities）而遭受了藥品召回。EMA與FDA等監(jiān)管部門隨即指定了針對藥物本身的亞硝胺雜質（NDSRI）限額標準（EMA 為每日允許攝入量 18 ng／天， FDA 為26．5 ng／天）。

由于多肽藥物結構以及多肽合成自身的屬性，它們遭受亞硝胺雜質侵擾的可能性相對于小分子較低。這個評估從兩個方面來看，首先，多肽分子中并不富含二級胺結構，因此不易產生亞硝胺。例外的情況來自于N－端的二級氨基酸（如脯氨酸，Sarcosine等）和烷基化的賴氨酸，但這種情況同上并不多見，因此產生多肽藥物為基質的亞硝胺NDSRI雜質的可能性不高。其次，由于多肽本身大分子量的特點，即便產生多肽亞硝胺雜質，其致癌性致突變的可能性也是極低的，因為它們形成的碳正離子很難與DNA的堿基之間產生有效的修飾反應，因此即便形成，也應該有很高的每日允許攝入量。

多肽合成需要注意的是那些使用�；�疊氮法液相縮合多肽的工藝，由于使用了亞硝酸鹽作為原料，因此有形成亞硝胺雜質的風險。但由于多肽合成中需要多步分離處理，以及最后的液相色譜純化，因此亞硝胺雜質即便形成，最終污染API的可能性 也較低。這種風險評估可以遵循FMEA的模式進行，F(xiàn)DA和EMA是可以接受沒有分析數(shù)據，但符合科學邏輯的評估手段。但對于那些使用亞硝酸鹽作為原料的多肽生產，還是強烈建議分析數(shù)個批次（具有統(tǒng)計學意義）的中間品或／和粗品或／和純品的亞硝胺以及亞硝酸鹽（后者容易遭受忽略）含量，以確認風險評估的有效性，并以實際數(shù)據證明產品質量不遭受亞硝酸鹽和亞硝胺雜質的影響。

｜ 引用資料

［1］ Wang M， Cheng G， Villalta PW， Hecht SS． Development of liquid chromatography electrospray ionization tandem mass spectrometry methods for analysis of DNA adducts of formaldehyde and their application to rats treated with N－nitrosodimethylamine or 4－（methylnitrosamino）－1－（3－pyridyl）－1－butanone． Chem Res Toxicol． 2007；20 （8）：1141–1148．

［2］ Loeppky RN， Goelzer P． Microsome－mediated oxidation of N－nitrosodiethanolamine （NDELA）， a bident carcinogen． Chem Res Toxicol． 2002；15（4）：457–469．

［3］ Yi－Chao Huang， Ge－Min Fang， Lei Liu， Chemical synthesis of proteins using hydrazide intermediates． National Science Review， 2016， 3， 107–116．

END

       原文標題 : Yi專欄 | 亞硝胺雜質對多肽藥物生產的影響