許多做出了偉大發(fā)現(xiàn)的科學家在回憶當年的情況時,都會說:“我偶然發(fā)現(xiàn)……”也許是一個反常的現(xiàn)象,也許是一串異常的數(shù)據(jù),又或者是一種從沒見過的奇怪事物。接著,根據(jù)教科書或史書上的記載,他們就順理成章地做出了偉大發(fā)現(xiàn),仿佛真理只是散落在草叢里閃閃發(fā)亮的寶石,運氣好的話彎腰撿起就能發(fā)大財。

當然,事實并非如此。實驗中出現(xiàn)的各類異常,很容易被當作雜音忽略,當作錯誤篩除,當作極端值排除。需要勇氣和眼光,才敢去、才能去冒險挖掘異常背后的故事。這場探險的旅程中,科學家是如何掌握線索、如果順藤摸瓜,如何檢索到數(shù)量稀少但卻至關重要的文獻的?他們怎樣全盤思考,怎樣尋找研究的切入點,怎樣搞清自己走到了哪一步?今天的文章講述了清華大學俞立老師發(fā)現(xiàn)和研究遷移體的歷程,希望帶給大家一些啟發(fā)。

撰文 | 俞立(膜生物學國家重點實驗室)

我現(xiàn)在還記得,那是2012年的一天。當時,我正在檢查前一天透射電子顯微鏡拍出的圖像。有個不尋常的東西吸引了我的眼球。那是一個位于細胞之外的囊泡,其中充滿了很多更小的囊泡,看起來像一只開口的石榴�；叵肫饋�,我以前見過類似的結(jié)構(gòu),但這張圖像的獨特之處在于,多個囊泡集中地位于胞外,有些內(nèi)部是空的,有些有少數(shù)小囊泡,還有些充滿了小囊泡。這張電鏡圖促使我開始思考這些結(jié)構(gòu)到底是什么。是死細胞的碎片?過于整潔了。是外泌體?體積太大了。是脫落小泡嗎?這倒是有可能,但囊泡內(nèi)部又有什么呢?很快,大家就把這種囊泡戲稱為石榴體(pomegranate-like structure,PLS),以這幅電鏡圖像為起點,我們開始了對石榴體的研究之旅。

為了鑒定出石榴體的標記蛋白,我們首先使用亞細胞分離法分離得到石榴體,再利用質(zhì)譜技術與綠色熒光蛋白(GFP)標記的方法,很快鑒定出石榴體上富集的多種蛋白。其中,四跨膜蛋白4(Tetraspanin4,Tspan4)大量富集于PLS,能夠作為一個很好的標記蛋白。但真正令我們吃驚的是,Tspan4同時會標記出與一個同細胞尾端相連的膜管網(wǎng)絡,而石榴體就位于這些膜管的分叉點或末端。它整體的外觀就像一個集成電路(圖1)�？焖贆z索文獻后,我們發(fā)現(xiàn)這些膜管是收縮絲(retraction fibers),首次發(fā)現(xiàn)于1963年(Taylor and Robbins, 1963)。不過,目前尚未有文獻報道過PLS結(jié)構(gòu)。利用綠色熒光蛋白標記的Tspan4,我們實時拍攝了石榴體的形成過程,并很快發(fā)現(xiàn)它與細胞遷移相關。當細胞遷移時,收縮絲被拉出,石榴體開始在收縮絲的末端或交接處生長。隨著細胞的不斷遷移,收縮絲斷裂,石榴體從細胞上脫離。鑒于石榴體的形成依賴于細胞遷移,我們把石榴體正式命名為遷移體(migrasome)(Ma et al．, 2015)。

圖1:L929細胞(譯注:一種小鼠成纖維細胞)中的遷移體。比例尺,20微米。

在發(fā)現(xiàn)遷移體后,最重要的問題是遷移體有什么功能。在當時的研究階段,我們無法真正回答這個問題,我們甚至不確定遷移體是否存在于活體內(nèi)。因此我們暫時繞開這一問題,轉(zhuǎn)而研究遷移體能做什么。它們是用來釋放細胞質(zhì)蛋白等細胞內(nèi)容物的嗎?的確,我們發(fā)現(xiàn)mCherry(譯注:一種紅色熒光蛋白)可以轉(zhuǎn)運到遷移體中,隨后通過遷移體從細胞中釋放出去。我們把這一過程命名為遷移性胞吐(migracytosis)。遷移體可以介導細胞間通訊嗎?我們發(fā)現(xiàn)一個細胞產(chǎn)生的遷移體可以被另一個細胞吞噬,這表明遷移體至少可能參與胞內(nèi)物質(zhì)在細胞之間的傳遞,因而可能介導細胞間通訊。雖然這些概念驗證性的實驗還不能告訴我們遷移體的功能究竟是什么,但這些結(jié)果讓我們提出了一系列假說,以引導下一階段的研究工作。

這些假說是:

1)遷移體產(chǎn)生于免疫細胞、轉(zhuǎn)移的腫瘤細胞以及正在發(fā)育階段中的細胞等遷移細胞中。2)遷移體由確定的遺傳通路調(diào)控;3)遷移體可以介導細胞間的通訊。

在過去幾年中,我們?yōu)槔斫膺w移體所做的探索性工作主要由以上假說引導,其中一些假說目前已經(jīng)得到證實。

除了假說之外,我們同樣需要一個研究策略。為了回答遷移體究竟具有什么功能(這可能是最重要的問題),我們需要建立一個研究遷移體的體內(nèi)模型。有了這個模型,我們就可以制備遷移體缺陷型動物,找到這些動物身上出現(xiàn)的問題,從而理解遷移體的生理功能。當然,在此之前,我們首先要知道哪些基因是形成遷移體所必需的。因此,我們將研究聚焦在研究遷移體的遺傳通路和構(gòu)建遷移體的體內(nèi)模型上。在這兩個目標之外,我們還需要開發(fā)研究遷移體的工具,特別是檢測遷移體的方法和探針。

我們現(xiàn)在只需要使用GFP標記的遷移體標志物,例如PH-GFP,就可以輕松地在顯微鏡下檢測到遷移體。此外,我們發(fā)現(xiàn)小麥精子蛋白WGA可以很好地將遷移體染色;基于這一發(fā)現(xiàn),我們開發(fā)了一項使用WGA來檢測遷移體的非常方便的方法。

遷移體形成時,伸縮絲從遷移細胞的軌跡邊緣被拽出,這意味著伸縮絲必須粘附在細胞外基質(zhì)上。由于整合素(integrin)是粘附于細胞外基質(zhì)的主要分子,同時我們的質(zhì)譜分析結(jié)果也顯示遷移體上富集著整合素,因此我們將目光聚焦在整合素上。研究顯示,具有活性的整合素在遷移體形成前就已經(jīng)集合在了收縮絲的端中,活性整合素復合物和細胞外基質(zhì)互相作用,沿著收縮絲搭建了多個粘附位點,這些位點隨后成為遷移體形成的位點(Wu et al．, 2017)。

目前,遷移體機制的研究進展大都起源于我們對遷移體形成過程的細胞生物學研究。鑒定出Tspan4是遷移體標志物后不久,我們還注意到,Tspan4似乎可以促進遷移體形成。Tspan4屬于四跨膜蛋白家族,該家族有33個成員蛋白。我們發(fā)現(xiàn),其中14個成員蛋白在過量表達的情況下都可以促進遷移體形成(Huang et al．, 2019)。所有的四跨膜蛋白都有4個跨膜結(jié)構(gòu)域,這些蛋白可以形成所謂的四跨膜蛋白富集的微結(jié)構(gòu)域(TEM)(Rubinstein, 2011)。TEM尺寸大約為100納米,富含一系列蛋白和脂閥類脂質(zhì),如膽固醇等。我們發(fā)現(xiàn),在遷移體形成過程中,很多小的TEM會聚集形成微米級別的宏結(jié)構(gòu)域,我們稱之為四跨膜蛋白富集的宏結(jié)構(gòu)域(TEMAs)。有意思的是,我們發(fā)現(xiàn)TEMA的形成與遷移體在收縮絲上的生長有關。這提示我們,TEMA的形成可能促使了收縮絲發(fā)生膜形變而形成遷移體。但是,我們怎么才能驗證這個想法呢?

實驗的關鍵進展源于一個意外的發(fā)現(xiàn)。在項目初期,我們計劃使用體外系統(tǒng)來研究Tspan4在膜上的行為。因此,我們需要將Tspan4-GFP導入巨型單層脂質(zhì)體(Giant Unilamellar Vesicle, GUV)中,觀察Tspan4-GFP在膜上的行為。于是,我們首先把Tspan4整合到了蛋白脂質(zhì)體中,隨后通過電擊融合蛋白脂質(zhì)體來制備GUV。結(jié)果令人大吃一驚——在Tspan4-GFP蛋白脂質(zhì)體電擊融合的過程中,我們觀察到了一些串珠狀的結(jié)構(gòu),與遷移體及收縮絲的結(jié)構(gòu)驚人的相似;而在對照組的蛋白脂質(zhì)體的融合過程中卻沒有出現(xiàn)這樣的結(jié)構(gòu)。這個發(fā)現(xiàn)提示,Tspan4可能自己就足以驅(qū)動遷移體的形成。然而,由于我們并不清楚電擊融合過程中究竟發(fā)生了什么,因此我們決定設計一個體外系統(tǒng),來模擬遷移體的形成過程。

指導我們設計體外系統(tǒng)的關鍵靈感是我們意識到遷移細胞產(chǎn)生的拉力是遷移體產(chǎn)生的關鍵因素。因此,我們設計了兩套不同的方案來將GUV拉成為膜管,以模擬收縮絲形成的過程。在第一套方案中,我們把GUV粘在流體小室中,然后使用液流推動GUV從而制造拉力。在第二套方案中,我們使用玻璃針頭手動從GUV拉出膜管。這兩套方案都讓我們成功地從鑲嵌了Tspan4-GFP的GUV中拉出膜管,在拉管過程中,TEM聚集形成TEMA,并在膜管上自發(fā)膨脹形成類似于遷移體的結(jié)構(gòu)。

但是,為何TEMA的聚集會導致膜管膨脹成遷移體呢?科研中最讓人難受的事莫過于做了一個完美的實驗卻無法解釋其結(jié)果。萬幸的是,我與以色列特拉維夫大學(Tel Aviv University)的邁克爾·科茲洛夫(Michael Kozlov)教授相識多年,他是個物理學出身的生物物理學家,是膜塑形領域的頂尖專家。邁克爾教授和他實驗室一位聰明的研究生本·祖克(Ben Zuker)很快為收縮絲到遷移體的膜形變過程建立一個數(shù)學模型。該模型表明,當組合出的Tspan4富集的宏結(jié)構(gòu)域的彎曲剛性超過膜的其余部位,收縮絲會自發(fā)地膨脹形成遷移體。這個模型可以用下面的類比來理解:假設我們有一個直徑恒定的橡皮筋,但是不同部位的彈性不一樣,當我們拉伸橡皮筋時,拉力會把橡皮筋拉長并拉細,硬的部位相比柔軟的部位拉伸得少,因此會更粗。這個模型預測,TEMA的硬度會是收縮絲其余部位的5-10倍大, 在后續(xù)工作中, 原子力顯微鏡直接測量了遷移體膜的硬度,證實了這一預測。因此,遷移體的形成是由簡單的物理過程所驅(qū)動的。

這一模型為我們提供了一個理解遷移體形成的理論框架。更重要的是,它確定了四跨膜蛋白在遷移體形成過程中的中心地位,此基礎上,我們得以在研究遷移體的生理功能。

在研究遷移體和遷移性胞吐的生理功能時,最重要且最困難的部分是建立合適的動物模型。當時我們并不知道遷移體會在什么時間、什么部位、在哪種動物里出現(xiàn)。為了讓搜索更加高效,我們制定了幾條衡量好模型的標準。首先,模型必須便于顯微鏡觀察。其次,模型需要容易開展遺傳操作。最后,我們想要的模型應該是很容易獲得的——如果隔壁實驗室就有,那就再好不過了。最后,我們決定嘗試斑馬魚胚胎。斑馬魚胚胎是透明的,因此是顯微鏡下研究的絕佳之選;而且基因敲除魚很容易得到;最重要的是,使用斑馬魚為模型的著名發(fā)育生物學家孟安明教授就在我們隔壁樓里。

我們首先構(gòu)建了表達遷移體標記蛋白的斑馬魚胚胎,并用活細胞成像技術觀察這些胚胎。第一次試驗中,我們就在活體胚胎里觀測到了大量的遷移體和收縮絲(Jiang et al．, 2019)。我們發(fā)現(xiàn)遷移體主要形成于原腸運動期。我們已經(jīng)知道了遷移體形成所必需的一系列基因,如itgb1b, tspan4a 和tspan7,因此我們制備了敲除上述三個基因的斑馬魚。我們發(fā)現(xiàn),遷移體的數(shù)量在敲除魚的胚胎中有所減少,更有趣的是,這些遷移體減少的斑馬魚都出現(xiàn)了器官形成的缺陷——最明顯的表型是不對稱發(fā)育缺陷,包括左右翻轉(zhuǎn),多種器官的雙側(cè)復制(譯注:即本該只在一側(cè)出現(xiàn)的器官長在了身體另一側(cè)或雙側(cè)都有)。

但這是否意味著敲除斑馬魚中的器官生成缺陷,是遷移體形成減少所致的呢?

答案是:并不一定。因為這些基因還具有與遷移體無關的其他功能,也可能是那些功能調(diào)控了器官生成。這樣說來,遷移體形成也完全可能與器官生成毫不相關。實際上,在很多領域里,當我們?nèi)パ芯磕硞�特定的細胞內(nèi)事件的生理功能時,都會遇到類似的問題,至今也沒有解決的辦法。好在我們可以純化遷移體,開展回補實驗(rescue)——從野生型斑馬魚胚胎里純化出遷移體,隨后注射到敲除魚的胚胎中。回補實驗顯示,敲除魚的胚胎在注射了遷移體后,成功地恢復了器官形成,這表明器官形成的確依賴于遷移體,而不是Tspan4和Tspan7基因中那些與遷移體無關的其他功能。

下一個問題,遷移體又是如何調(diào)控器官生成的呢?我們推斷遷移體可能包含某些信號分子,這些分子會在器官生成過程中指導細胞做出正確響應。為了檢測這個理論,我們使用定量質(zhì)譜的方法分析了純化的遷移體。我們發(fā)現(xiàn),遷移體中的確富集了一批配體分子,如趨化因子、細胞因子、形態(tài)發(fā)生素、生長因子等。其中,我們特別注意到了趨化因子CXCL12,因為CXCL12a的敲除魚出現(xiàn)了和遷移體缺陷魚相似的不對稱發(fā)育缺陷。此外,將野生斑馬魚胚胎中的遷移體注射入CXCL12a敲除的斑馬魚胚胎中,能夠成功恢復不對稱發(fā)育的缺陷。因此,我們認為CXCL12是遷移體調(diào)控不對稱發(fā)育中的關鍵分子。

在斑馬魚胚胎中,有一種帶纖毛的器官叫庫氏泡(Kupffer’s vesicle,KV),它能導致其他器官的左右不對稱發(fā)育。我們發(fā)現(xiàn),遷移體對KV的形成是必需的:在遷移體缺陷的胚胎中,KV不能有效形成。KV由一組遷移性前體細胞發(fā)育而來,這組細胞被稱為背部先驅(qū)細胞(dorsal forerunner cells, DFCs)。在遷移體缺陷胚胎中,DFCs在遷移過程中跑散了,無法到達它們的目的地。這提示了一種可能性,即,遷移體作為區(qū)域性的趨化信號,指引遷移型DFC到達胚胎正確位置。為驗證這一假說,我們從野生型胚胎中純化得到遷移體,把它們嵌入瓊脂糖珠上,隨后將這些珠子插入胚胎的腹部一側(cè)(正常情況下DFCs不會在腹部出現(xiàn))。我們發(fā)現(xiàn),含有遷移體的珠子可以吸引DFCs到達腹部。因此確認,遷移體是DFCs的趨化信號。

現(xiàn)在,拼圖還剩最后一塊沒有完成。如果遷移體是DFCs的趨化信號,它們一定需要在DFCs遷移路徑的終點區(qū)域富集。目前的研究已證實DFCs會在胚盾(譯注:即embryonic shield,脊椎動物胚胎發(fā)育初期出現(xiàn)的不透明盾牌樣結(jié)構(gòu))富集;因此我們檢查了胚盾周圍的區(qū)域。讓我們意外的是,我們在胚盾下方發(fā)現(xiàn)了一個大空腔,并稱之為“胚盾腔”(embryonic shield cavity)。遷移體在這個腔體內(nèi)高度富集;當我們向斑馬魚胚胎注射純化的遷移體時,它們最終會停留在胚盾腔里。這也可以解釋我們的補救實驗為何能夠成功。

以上這些工作確立了遷移體首個已知的生理功能,更重要的是,它提供了一個范例,可用來研究遷移體如何在其他生命過程中起作用。在這個范例中,信號分子被打包裝入遷移體中,隨后由遷移體在指定地點釋放,從而激活周圍的細胞。從這個意義上來說,遷移體可以整合空間、時間和特定化學信息,這些信息對協(xié)調(diào)胚胎發(fā)育等復雜生命過程中的細胞群體行為不可或缺。簡而言之,遷移體就是帶寄送地址的信息包裹。

圖2:遷移體的功能。

待解謎題The Known Unknowns

從我們的研究延伸開去,還存著很多明顯的問題有待回答。此處總結(jié)如下,并分享一些我的想法。

1)遷移體的生物發(fā)生機制究竟是什么?

當前,除了我們鑒定到的少數(shù)分子,控制遷移體形成的信號通路仍不為人知。甚至,我們對遷移體的眾多基本特點仍不夠理解。例如,遷移體內(nèi)部的囊泡是什么?這些囊泡是如何進入遷移體的?它們有何功能?

2)遷移體水平傳遞是否有生理功能?

我們知道遷移體能夠被周圍細胞吞掉,這可能是細胞之間物質(zhì)傳遞的一種機制。最近,我們發(fā)現(xiàn)遷移體中會選擇性地富集一些種類的mRNA,當遷移體被周圍細胞吞掉后,遷移體中的mRNA會在吞掉遷移體的細胞中翻譯成蛋白,并改變該細胞的行為 (Zhu et al, Cell Research, accepted)。當前,我們還不清楚遷移體除mRNA和蛋白外還可以傳遞哪些物質(zhì),也不清楚這種細胞間物質(zhì)傳遞是否在體內(nèi)發(fā)生并具有生理功能。

3)除了胚胎發(fā)育,遷移體還在哪些生物過程中起到重要作用?

很多免疫細胞在發(fā)育和免疫應答過程中會發(fā)生遷移,并分泌大量信號分子。這聽上去就像是遷移體可以大展身手的場景。

4)遷移體有細胞自主性的功能嗎?

細胞可否使用遷移體來吐出不想保留的物質(zhì)?這樣可以維持自身穩(wěn)態(tài)、丟棄受損或有害的細胞成分、維持表面分子數(shù)目的最優(yōu)水平……

5)遷移體的進化起源是什么?

它們來源于進化早期的單細胞生物,還是在多細胞生物出現(xiàn)后才出現(xiàn)?使用動物界內(nèi)早期分支的模式生物系統(tǒng),或許能夠幫助我們回答這個有意思的問題。

科學史提醒我們,在我們能想到的待解之謎外,總有“未知的”未知——憑我們現(xiàn)有的知識,根本無法預料將來還會遇到哪些問題。面對這些未知的未知,我們必須承認,大自然總是比我們想的更復雜。我們要有一顆敢于不斷挑戰(zhàn)已有模式的心,也需要有一雙銳利的眼睛,能挑出現(xiàn)有理論框架下無法解釋的現(xiàn)象。懷著這樣的心態(tài),或許再加上點好運,我們終將開啟滿是未知卻新奇的世界。

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